一、色譜柱的分類
基于不同原理和角度,高效液相色譜柱和固定相可以有不同的分類方式。液固色譜固定相按基質材料可分為無機氧化物、聚合物等主要類型;按結構和形狀分為薄殼型和全孔型,無定形和球形,整體柱等;按固定相表面改性與否分為吸附型和化學鍵合型;按照分離模式可以分為正相、反相、離子交換、疏水作用、體積排阻、親和、手性等類型;按照分離規模及色譜柱的幾何尺寸,可以分為制備柱、分析柱、微型柱等類型。表1中已經給出了按照分離模式分類的原理及適用范圍;表2中列出了柱型與樣品容量的關系。
表1 液相色譜法分類
按固定相形態分類 | 按作用原理分類 | 按物理特征分類 | |||
固定相 | 名稱 | 原理 | 名稱 | 特征 | 名稱 |
液體 | 液-液色譜 | 分配 | 液-液分配色譜 | 平面固定相 | 平面色譜 |
固體 | 液-固色譜 | 吸附 | 液-固吸附色譜 | 紙固定相 | 紙色譜 |
分子大小 | 體積排阻色譜 | 薄層固定相 | 薄層色譜 | ||
離子交換能力 | 離子交換色譜 | 顆粒固定相填充 | 填充色譜 | ||
親和力 | 親和色譜 | 色譜柱中空 | 空心柱色譜 | ||
電滲及電泳 | 毛細管電泳 | 采用高壓流動相 | 高壓液相色譜 |
表2 液相色譜的不同柱型
柱 型 | 柱內徑 | 流動相流速 | 樣品容量 |
制備注 | 4in(≈100mm) | 960ml/min | 2.5g |
制備柱 | 2in(≈50mm) | 240ml/min | 600mg |
制備柱 | 1in(≈25mm) | 61ml/min | 150mg |
半制備柱 | 9mm | 11ml/min | 25mg |
常規柱 | 4.6mm | 0.5~2.0ml/min | 0.2~7mg |
細內徑柱 | 2.1mm | 0.2~0.4ml/min | 0.05~0.2mg |
微柱 | 0.8~1.0mm | 25~60μl/min | 50~500mg |
毛細管柱 | 0.1~0.5mm | 1~15μl/min | 1~50μg |
納米柱 | ≤ 0.1mm | ≤ 1μl/min | ≤ 1μg |
二、色譜柱的結構
現代高效液相色譜大多采用小粒徑固定相以獲得高柱效,較大的阻力需要在高壓下運行,這也要求色譜柱及其連接必須滿足耐高壓、不泄漏、死體積小等條件。為了保證色譜だ具有良好的密封性能,通常使用帶錐套的線密封連接方式。圖1給出了常見的高效液相色譜柱結構。
圖1 色譜柱結構
1—塑料保護堵頭;2—柱頭螺栓;3—刃環;4—密封圈;5—篩板;6—色譜柱管;7—固定相
在圖1中,當旋緊柱頭螺母時,刃環在壓力作用下向左方移動,刃環前端很海的邊沿在擠壓下會變形并包緊色譜柱管,同時與錐面接觸形成環狀的密封面。這種由金屬在高壓下變形而形成的密封緊密可靠,可保證色譜柱在非常高的壓力下正常工作。
不同廠家生產的色譜柱出口和入口的接頭長度和刃環的角度不同,因此,不同品牌的色譜柱可能需要使用不同的金屬刃環和接頭,可采用通用接頭或者PEEK接頭。
三、柱性能評價
色譜柱的類型和構型(粒度、長度、內徑等)選擇通常由分離目的決定,對特定類型的色譜柱,不同的品牌之間也可能存在很大的差異。色柱要求的主要性能指標包括理も相濃度、色譜柱的穩定性等。
許多生產商為每支色譜柱提供測試色譜圖和前四項數據,有的廠家也提供同一批次或不同批次保留值重現性的數據、鍵合相濃度數據與柱穩定性數據
1.理論塔板數
塔板數(M)是色譜柱的一個基本參數,一支色譜柱的理論塔板數越高,則流出曲線的方差或峰寬越小,色譜峰越尖銳,表明色譜柱對溶質的分離能力強,即柱效高
提高色譜柱理論板數的因素包括:色譜柱填充良好、增加色譜柱長度、在最佳流速下運行、采用較小粒度固定相、采用低黏度流動相、升高色譜柱溫度、采用小分子化合物測定。
表3中給出了填充良好的各種長度與粒度不同固定相的典型HPLC色譜柱在最佳條件下的塔板數(采用小分子中性樣品,分子量約為200)。
表3 在最佳測試條件下,填充良好的HPLC色譜柱的塔板數
微粒直徑/μm | 柱長/cm | 塔板數N |
10 | 15 | 6000~7000 |
10 | 25 | 8000~10000 |
5 | 10 | 7000~9000 |
5 | 15 | 10000~12000 |
5 | 25 | 17000~20000 |
3 | 5 | 6000~7000 |
3 | 7.5 | 9000~11000 |
3 | 10 | 12000~14000 |
3 | 15 | 17000~20000 |
1.7 | 5 | 約10000 |
一般情況下,正常裝填的色譜柱對小分子樣品分離的理論塔板數可近似表示為:
式中,L為柱長,cm;dp為固定相粒徑,μm。
2.峰不對稱度
不對稱的色譜峰可能導致塔板數與分離度測定不準確、定量不準確、分離度降低與檢不出峰尾中的小峰、保留值的重現性不好等
實際工作中,通常采用峰不對稱因子As表示峰形的不對稱度或拖尾程度,理想色譜峰的As值為0.95~1.1(對稱峰As=1.0),實際分析中被測樣品的As值一般應小于1.5。
《美國藥典》、《中國藥典》等規定用色譜柱拖尾因子(T)表示色譜峰的對稱性。表4中列出了兩者的對應關系:
表4 峰不對稱因子與峰拖尾因子的關系
峰不對稱因子(10%峰高) | 1 | 1.3 | 1.6 | 1.9 | 2.2 | 2.5 |
峰拖尾因子(5%峰高) | 1 | 1.2 | 1.4 | 1.6 | 1.8 | 2 |
3.滲透性
色譜柱的滲透性可以用特定條件下的壓力降作為衡量指標。滲透性與運行條件、色譜柱尺寸和固定相粒度有關。隨色譜柱增長和固定相粒徑減小反壓升高,用不規則微粒固定相填充的色譜柱壓力可能會較高。不同品牌的固定相粒度分布范圍差別較大,因此反壓也可能有很大的差異。供應商報告的反壓一般是在特定操作條件下測試的結果。
球形固定相填充的色譜柱的壓力降可近似表示為:
式中,P為壓力降,psi(1psi-6894.76Pa);n為流動相黏度,cP
4.柱體積
不同規格的色譜柱所填充的固定相量很容易被估算,但是由于不同品牌、基質的固定相密度差別較大,估算的結果有時偏差較大。高效液相色譜柱的固定相填充體積與質量之間的近似關系在表5中給出。
表5 填充高效液相色譜柱體積計算表
OD×L/(mm×cm) | 色譜柱管總體積[π(OD/2)2L]/ml | 固定相體積/ml | 固定相質量/g |
1.0×100 | 0.086 | 0.06 | 0.07 |
1.0×150 | 0.114 | 0.08 | 0.10 |
2.1×100 | 0.343 | 0.24 | 0.29 |
2.1×150 | 0.529 | 0.37 | 0.45 |
4.6×100 | 1.657 | 1.16 | 2.11 |
4.6×150 | 2.500 | 1.75 | 2.11 |
4.6×250 | 4.143 | 2.90 | 3.50 |
7.8×300 | 14.343 | 10.04 | 12.12 |
10.0×150 | 11.786 | 8.25 | 9.96 |
10.0×250 | 19.643 | 13.75 | 16.59 |
10.0×300 | 23.557 | 16.49 | 19.90 |
21.0×250 | 86.586 | 60.61 | 73.15 |
50.0×250 | 490.871 | 343.61 | 414.69 |
色譜柱的死體積是指色譜柱中除固定相之外的體積,不同規格色譜柱的大約死體積如表6所示。對常規分析柱,內徑4.6mm、柱長150mm和250mm的色譜柱死體積分別約為1.5ml和2.5ml,當流動相線速度為1ml/min時,死時間約為1.5min和2.5min。
表6 不同規格色譜柱的死體積
色譜柱種類 | 柱長/mm | 柱內徑/mm | 大約死體積 |
納米柱 | 150 150 | 0.075 0.10 | 400ml 700ml |
毛細血管柱 | 150 150 | 0.3 0.5 | 6μl 15μl |
微徑柱 | 150 | 1.0 | 70μl |
細內徑柱 | 15 30 50 | 2.1 2.1 2.1 | 30μl 60μl 100μl |
溶劑節省柱 | 100 150 | 3.0 3.0 | 0.43ml 0.64ml |
分析柱 | 15 30 50 75 150 250 | 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 | 0.15ml 0.30ml 0.50ml 0.75ml 1.5ml 2.5ml |