色譜柱使用一段時間后，柱效將會下降，必須進行再生處理。再生處理包括活化（自右向左）和凈化（自左向右）兩種。對不同的填料處理方法不同，同一種填料也可以采用不同的處理方法。硅膠、氧化鋁和極性（正相）鍵合相色譜柱可以采用以下程序再生:三甲基戊烷或己烷三氯乙烷→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水，采用上述溶劑依次以1 ml/min的流速通過色譜柱，洗脫量約為20ml。然后反方向重復上述過程。
反相色譜柱常用甲醇—水或乙腈—水作流動相，有時還可能含有控制pH值的鹽、酸或離子型溶劑。對硅膠或以硅膠為基質的鍵合（或離子交換）填料，為避免硅膠溶解，pH值不應超過8.5。再生時將25ml純甲醇及25ml甲醇—氯仿（1:1）混合液依次通過色譜柱淋洗，然后用所選的流動相平衡。
離子交換色譜柱的再生方法有兩種:①先用25m蒸餾水通過柱子以除去所有的緩沖鹽類:然后采用25ml甲醇沖洗柱子，以除去由于分配效應而殘存在骨架中的雜質；再用25m蒸餾水除去不溶于甲醇的殘存鹽類:最后用緩沖液平衡。②先用0.1mol/L的檸檬酸洗滌；然后用水洗滌（不要用堿性溶液，以防硅膠基質溶解）；最后用緩沖液平衡。
如果柱頭被污染，可以在出口處用輸液泵反相壓入溶劑，通常選用有一定黏度的溶劑（如甘油-水或水-甲醇），將填料從內慢慢推出少許，停泵，切除柱頭已污染的填料，放入燒杯中清洗后，再重新裝填，測定柱效至達到要求。
常見色譜柱再生用溶劑及其順序見表5，帶金屬抗衡離子的聚合物色譜柱的再生方法見表6。
常見色譜柱再生用溶劑及順序
固定相類型 | 再生溶劑及順序 |
正相固定相 | 用四氫呋喃沖洗；甲醇沖洗；四氫呋喃沖洗；二氯甲烷沖洗；無苯正己烷沖洗 |
反相固定相 | 用HPLC級水沖洗，在沖洗過程中加入4等份200μl的二甲亞砜（DMSO）；依次用甲醇、氯仿、甲醇沖洗 |
陰離子交換固定相 | 依次用HPLC級水、甲醇、氯仿沖洗 |
陽離子交換固定相 | 用HPLC級水沖洗，在沖洗過程中加入4等份200μl的DMSO；四氫呋喃沖洗 |
蛋白質凝膠固定相 | 去除蛋白質尺寸排阻介質中的污染物有兩種清洗/再生的方法：①弱保留蛋白質，用30mol/LpH=3.0的磷酸鹽緩沖液沖洗；②強保留蛋白質，用100%的水到100%的乙氰梯度洗脫60min |
帶金屬抗衡離子的聚合物色譜柱的再生方法
色譜柱類型 | 金屬污染物 | 有機污染物 | 色譜柱清洗 |
氫離子型 | 用25℃的0.1mol/LH2SO4溶液以0.1ml/min的流速反向洗4~6h | 用25℃的20：80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向沖洗 4h | 用65℃的20：80的乙氰0.01mol/LH2SO4溶液以0.1ml/min的流速反向沖洗4h |
鈣離子型 | 用25℃的0.1mol/LpH=6.3的Ca(NO3)2溶液以0.1ml/min的流速反向沖洗4~16h | 用25℃的20：80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向沖洗4h | 用25℃的20：80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向沖洗4h |
鈉離子型 | 用85℃的0.1mol/L的NaNO3溶液以0.1ml/min的流速反向沖洗4~16h | 用25℃的20：80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向沖洗4h | 用25℃的20：80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向沖洗4h |
銀離子型 | 沒有再生過程報道 | 用25℃的20：80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向沖洗4h | 用25℃的20：80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向沖洗4h |
鉛離子型 | 用85℃的0.1mol/LpH=3.3的Pb(NO3)2溶液以0.1ml/min的流速反向沖洗4~16h | 用25℃的20：80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向沖洗4h | 用25℃的20：80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向沖洗4h |