通常的親和色譜主要用于蛋白質分子的凈化。它的具體過程如下:能和目標蛋白質分子親和的基質(又稱親和物)以共價鍵的方式與不溶性的固定相鍵合(一般要通過一個連接劑作為中介);然后利用有選擇性的親和力與目標蛋白質(某一個或某一類)的活動中心可逆性地結合;被分離體系中其他蛋白質被淋洗出;再通過某些方式把已經結合的目標蛋白質釋放出來,這種分離和凈化蛋白質的方法稱為親和色譜法。
現在把抗體以共價鍵方式鍵合到分離柱的固定相上,用它可逆性地結合該抗體所對應的抗原,由此在一個很復雜的體系中快速、有效地萃取濃度很低的小分子目標抗原,這就是免疫親和萃取法(IAE)。由于抗體和抗原是高度選擇性的結合,可以把它們看作鎖體和鑰匙的關系,也就是一把鑰匙配一把鎖的選擇性。這樣,既可萃取又可濃縮的IAE是目前最為有效的純化方法,并且使緊隨后面的檢測達到低于10-9的靈敏度。實際上IAE也可以用來對目標蛋白質進行純化,只需把抗原結合在固定相上即可。
不過,實施這一方法時也應注意到以下幾個方面,即避免抗體與目標物的類似物相結合而影響選擇性和結果的不準確,因而要提高抗體的純度;另外大的容量和柱的耐用性也需考慮。后者涉及IAE柱所使用的固定相材料,它應由一種均一的、并具有化學和生物惰性的多孔剛性粒子構成,能夠耐受相當的壓力和流速,例如HPLC/MS在線聯用系統中,能承受6.9MPa (1000psi)壓力和2?4mL/min的流速。
圖是IAE應用的一個例子。康力龍(stanozolol)是一種促蛋白激索,用作甾體類興奮劑。使用IAE法純化康力龍的效果可由GC/MS測試結果所見。圖是尿樣中常規的溶劑萃取康力龍后的GC/MS測定結果,由于高的本底,在總離子流圖上幾乎看不到它的色譜峰;(2)是尿樣經過更為合適的溶劑萃取,如固相萃取,可以降低本底信號為原來的1/5; (3)是使用IAE萃取后本底信號降低為原來的1/50。尿中低濃度的康力龍被IAE萃取而濃縮,在尿中其他組分被洗脫的前提下降低了 GC/MS的檢測本底,從而突出了它的信號強度。
