實驗室分析方法液相色譜的定量方法—信號測量

HPLC不僅是一種分離手段,同時也是一種優良的定量分析技術。它不僅能夠用于對樣品(包括純樣品)中基本或主成分的定量,還能用于對中等濃度多組分混合物的分析以及基體中痕量(10^-9或更低)雜質的濃度評價。精心設計行之有效的分析方法可以對主成分的分析在準確度和精密度兩方面顯示出較高的水平[精密度為±(1%～2%);準確度為±2%]。色譜法定量的依據是:樣品中各組分的質量或其在流動相中的濃度與檢測器的響應信號成正比關系。因此,進行色譜定量分析時需要準確測量檢測器的響應信號(峰面積或峰高);準確求得比例常數(校正因子);正確選擇合適的定量計算方法,將測得的峰面積或峰高換算為組分的含量。

1.噪聲與漂移

在介紹的HPLC檢測器評價方法中已經詳細論述了檢測器噪聲與漂移的測定方法。然而,對HPLC分析方法來說,仍然需要確定噪聲與漂移。盡管皆通過相應的檢測器加以測量,然而兩者有著本質的差別。前者只是單純地評價一個單元組件,后者與整個儀器系統及分析方法有關。

噪聲是指在沒有分析物的情況下基線信號值的不穩定程度,可分為短期、長期和基線飄移三種基本類型。

檢測器噪聲、泵系統的脈動以及積分系統的電子噪聲等許多因素均會引起短期噪聲。長期噪聲可由外在因素或系統本身引起,長期噪聲一旦被識別,一般在確定HPLC方法之前可以被校正。

基線漂移被認為是一種特殊類型的長期噪聲,梯度洗脫過程中經常出現。前一次進樣洗脫的組分可能會被看作基線飄移,這些強保留組分在再次進樣時才被洗脫掉。譜帶很寬,有時很難與其他類型的基線飄移區別開來,這種基線問題常在等度分離中出現。修正基線漂移也可能得到較精確的峰高和峰面積的測量結果,色譜工作站一般能夠對基線飄移做出很好的修正。

基線飄移有時由檢測器性能的變化造成。有些示差檢測器對溫度波動特別敏感,檢測器單元中任何溫度改變均會導致輸出信號嚴重飄移。在UV檢測器中,燈(老化)的強度或二極管或光電管強度的變化有時也會導致基線飄移。

色譜儀開機預熱20min后,記錄基線1h,取1h內平行包絡線的中心線的起點與終點的差值為檢測器基線漂移(圖1)。選取所記錄基線中噪聲較大的5min作為計算噪聲的基線以1min為界畫平行包絡線(如圖2所示),按式(1)計算短期基線噪聲。五個平行包絡線寬度的平均值作為檢測器短期基線噪聲。 

圖1 基線漂移計算示意圖

圖2 短期基線噪聲計算

(1)

式中,N_d表示短期基線噪聲;y_i表示第i個平行包絡線基線寬度;n是平行包絡線的個數(此處n=5)。 

2.峰高

檢測器測量被測組分響應值的最簡單表達方式是信號峰的高度。對完全分離的單一組分,峰高是指從基線到峰頂點的距離,其中基線值取峰前和峰尾多點數據的平均長期噪聲或飄移造成基線改變時,須修正峰高的測量值。

對完全沒有分開的峰,可以使用切線鏟削的方法來確定峰高,如圖3中的主成分峰與峰1。但切線鏟削法僅適用于那些小峰處于大峰拖尾部分的情況。不同的色譜工作站對基線的選取、峰起落點的確定有一些差異,因此對這種復雜情形的處理結果可能也會存在一定的差異。

圖3 HPLC中的峰高測量

3.峰面積
峰面積是HPLC中最常用的定量方法。完全分離色譜峰的峰面積可定義為信號強度在峰開始到峰終止的這段時間內面積的積分值。

測量峰面積的準確性取決于多種因素,其中基線的正確選取,精確地定義峰起落點是關鍵,需要收集足夠的數據以精確評價真實峰面積。不對稱峰或拖尾峰很難確定峰的起落點,從而導致定量不準。色譜工作站中皆有計算峰面積的功能,也可以利用手工來完成。

大多數色譜工作站的峰檢測(對峰面積而言)是利用一設定的閾值來判斷峰的起落點。不恰當的值設定將會影響定量的準確度,對不同的方法建立可以人工干預進行適當調整。

(1)對稱峰的峰面積的測量 

手工計算峰面積通常采用“峰高×峰半寬法”。對于對稱峰形,峰面積計算公式為:

(2)

式中,系數1.065為色譜峰與三角形面積之間的校正系數。 

按式(2)計算峰面積時,需注意峰寬測量的準確性。對峰寬小于2mm的色譜峰,通過放大色譜峰后進行測量可以減小計算誤差。

(2)不對稱峰的峰面積的測量 

在色譜分析中,經常會遇到不對稱的色譜峰,如圖4所示。對于此類色譜峰,可采用峰高乘以平均峰寬法計算色譜峰峰面積。即選取峰高與在峰高的0.85和0.15處峰寬平均值的乘積來表示該色譜峰峰面積。

(3)

式中,W_0.85、W_0.15分別為峰高的0.85處和0.15處的峰寬。

圖4 不對稱色譜峰面積的測量

(3)大峰上的小峰的峰面積測量 

分析某主成分中痕量組分時,痕量組分色譜峰會受到主峰的干擾,經常會出現下面的情況:主峰未回到基線,雜質已開始出峰,或在主峰前沿出現一個雜質小峰。常見的情況如圖5所示,此時測量附在主峰上的雜質小峰峰面積的關鍵在于如何確定色譜峰峰高。

 圖5 大峰上小峰面積測量

圖5(a)所示的峰形,沿主峰底部劃出雜質峰的基線,由峰頂點A作主峰基線的垂線AD,與雜質峰的峰底相交于點E,則AE為雜質峰的峰高(h)峰高一半處峰寬為b,則雜質峰峰面積為A=h·b。

圖5(b)所示的峰形,首先作峰起點A和終點B的連線AB,從小峰頂點C作AB的垂直線交AB于E,則CE即為小峰的峰高(h),CE一半處峰寬為b(過CE中點作AB平行線,可得b),則雜質峰峰面積為A=h·b。

圖5(c)所示的峰形,作峰起點A和終點B的連線,過峰頂點C作AB的垂線,與BA延長線相交于E點,CE即為小峰的峰高(h),CE一半處峰寬為b(過CE中點作AB平行線,可得b),則雜質峰峰面積為A=h·b。

(4)基線漂移時色譜峰面積的測量 

如果峰面積測量時發生基線漂移,當靈敏度不改變時,若產生的色譜峰形狀與大峰上小峰的形狀相似,計算方法同上。圖6所示的峰形,基線的漂移程度不大、色譜峰比較窄。首先劃出漂移基線AB,過峰頂點E作時間坐標的垂線,交AB于F,EF即為峰高(h),過EF中點作時間坐標的平行線,得到該色譜峰的半高峰寬(b),該色譜峰峰面積A=h·b。

圖7所示的峰形,基線AB漂移較大、色譜峰較寬,此時由頂點E作AB的垂線,與AB相交于G,EG即為色譜峰峰高(h),過EG中點作漂移基線的平行線與色譜峰兩側分別相交于F、H、FH即為半高峰寬(b),該色譜峰峰面積A=h·b。

圖6 基線漂移較小的峰面積測量

圖7 基線漂移較大時的峰面積測量

圖8所示的峰形,2號峰測量時所用的靈敏度與1號峰和3號峰不同,如果變換靈敏度時不影響2號峰的起點和終點的記錄,則基線位置及色譜峰面積可按前面所述方法確定。若變換靈敏度時,2號峰的起點和終點位置不能明確確認時,確定峰高較為復雜。先作1號峰和3號峰所用靈敏度檔的漂移基線,再由2號峰頂點M作時間坐標的垂線,交漂移基線于A,交時間坐標于O將OA的距離乘(或除)以變擋的倍數,即可確定變擋后漂移的基線與峰高的交點B,連接原點與B,即可得變擋基線MB即為峰高(h),過MB中點作變擋基線的平行線可得2號峰半高峰寬(b)。2號峰的峰面積A=h·b。

圖8 靈敏度改變時峰面積的測量

 (5)重疊峰的峰面積測量 

色譜分析中常遇到不能完全分離的重疊峰,如圖9和圖10所示,其色譜峰面積測量有所差異。

圖9所示的峰形,兩色譜峰交點位于小峰半峰高以下,可按上述方法測量色譜峰高及半高峰寬,色譜峰峰面積可按峰高(h)和半高峰寬(b)的乘積計算。

圖10所示的峰形,兩色譜峰交點位于小峰半峰高以上,可采用谷-谷切割,由交點Y作基線的垂線,將兩色譜峰分開,然后可用積分儀測量由該垂線分開的兩個色譜峰的峰面積。用此方法測量峰面積,當兩色譜峰峰高(或峰面積)不等時,小峰峰面積測量的相對誤差將隨大峰與小峰的峰高(或峰面積)比值的增大而顯著增大。 

圖9 兩峰重疊交點低于小峰半峰高

圖10 兩峰重疊交點高于小峰半峰高

隨著電子信息科學的發展以及計算機應用的普及,絕大部分色譜儀都配備了積分儀色譜數據處理機——色譜工作站,使色譜峰高和峰面積的測量變得相對簡單,同時減少了峰高和峰面積的測量誤差,提高了儀器的自動化程度。根據需要,人們可預先設定積分參數(半峰寬、峰高和最小峰面積等)和基線,儀器根據這些參數來計算每個色譜峰的峰高和峰面積,并直接給出峰高和峰面積的結果,以便于定量計算使用。但當計算機無法正確識別一個完整的色譜峰,以至于計算結果出錯時,也需要人為地正確調整色譜峰的起落點,增加或刪除色譜峰,以保證結果的準確性。

色譜圖上基本的定量數據是峰面積和峰高,色譜定量分析的基礎是得到的峰面積(或峰高)和進樣量呈函數關系。因此在定量分析時,必須得到峰面積(或峰高)的數據,其測量的準確程度將直接影響定量結果的準確度,峰面積測定需根據不同的色譜峰形采用不同的測量計算方法。峰高和峰面積均可以在HPLC中作為定量依據,對于近似對稱的色譜峰,計算峰高要比計算峰面積優越得多。

對于一定的樣品,如果操作條件保持不變,在一定的進樣量范圍內,半高峰寬基本不變,峰高可直接代表組分的濃度。由峰高代替峰面積計算,方法快速、簡便,適用于固定不變的常規分析。與使用面積定量法比較,對于出峰早的組分由于半高峰寬很小,相對測量誤差大,這時用峰高定量更準確。對于出峰晚、峰較寬的組分,用峰面積定量更準確。檢測器的響應值受多種因素的影響,且這些因素對峰高和峰面積的影響并非一致,表1中對不同因素的影響極其定量方法的選擇作了系統總結。

表1 色譜參數變化與定量方法選擇

①峰形嚴重拖尾。