酶聯免疫檢測儀是酶聯免疫吸附試驗的專用儀器又稱微孔板檢測器。可簡單地分為半自動和全自動2大類,但其工作原理基本上都是一致的,其核心都是一個比色計,即用比色法來進行分析。 測定一般要求測試液的最終體積在250μL以下,用一般光電比色計無法完成測試,因此對酶標儀中的光電比色計有特殊要求。
原理
酶標儀實際上就是一臺變相光電比色計或分光光度計,其基本工作原理與主要結構和光電比色計基本相同. 圖示是一種單通道自動進樣的酶標儀工作原理圖.光源燈發出的光波經過濾光片或單色器變成一束單色光,進入塑料微孔極中的待測標本.該單色光一部分被標本吸收,另一部分則透過標本照射到光電檢測器上,光電檢測器將這一待測標本不同而強弱不同的光信號轉換成相應的電信號.電信號經前置放大,對數放大,模數轉換等信號處理后送入微處理器進行數據處理和計算,最后由顯示器和打印機顯示結果. 微處理機還通過控制電路控制機械驅動機構X方向和Y方向的運動來移動微孔板,從而實現自動進樣檢測過程.而另一些酶標儀則是采用手工移動微孔板進行檢測,因此省去了X,Y方向的機械驅動機構和控制電路,從而使儀器更小巧,結構也更簡單.
微孔板是一種經事先包理專用于放置待測樣本的透明塑料板,板上有多排大小均勻一致的小孔,孔內都包埋著相應的抗原或抗體,微孔板上每個小孔可盛放零點幾毫升的溶液.
光是電磁波,波長100nm～400nm稱為紫外光,400nm～780nm之間的光可被人眼觀察到,大于780nm稱為紅外光。人們之所以能夠看到色彩,是因為光照射到物體上被物體反射回來。綠色植物之所以是綠色,是因為植物吸收的大部分為紅橙光和藍紫光,但對綠色不吸收,反射出來,所以植物呈現為綠色。酶標儀測定的原理是在特定波長下,檢測被測物的吸光值。
隨著檢測方式的發展,擁有多種檢測模式的單體臺式酶標儀叫做多功能酶標儀,可檢測吸光度(Abs)、熒光強度(FI)、時間分辨熒光(TRF)、熒光偏振(FP)、和化學發光(Lum)。
酶標儀從原理上可以分為光柵型酶標儀和濾光片型酶標儀。光柵型酶標儀可以截取光源波長范圍內的任意波長,而濾光片型酶標儀則根據選配的濾光片,只能截取特定波長進行檢測。
檢測單位
光通過被檢測物,前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量,特定波長下,同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系。
檢測單位用OD值表示, OD是optical density(光密度)的縮寫,表示被檢測物吸收掉的光密度, OD=log(1/trans),其中trans為檢測物的透光值。根據Bouger-amberT-beer法則,OD值與光強度成下述關系:
E=OD=log(lo/Ι) 其中E表示被吸收的光密度, Ιo 為在檢測物之前的光強度,Ι為從被檢測物出來的光強度。
OD值由下述公式計算:
c為檢測物的濃度 b為檢測物的厚度 a為摩爾因子
在特定波長下測定每一種物質都有其特定的波長,在此波長下,此物質能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長段,就會造成檢測結果的不準確。因此,在測定檢測物時,我們選擇特定的波長進行檢測,稱為測量波長。
但是每一種物質對光能量還存在一定的非特異性吸收,為了消除這種非特異性吸收,我們再選取一個參照波長,以消除這個不準確性。在參照波長下,檢測物光的吸收最小。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。
檢測值計算
儀器中的檢測器接收透過被檢測物的光能量,轉換成二進位數字信號,最大為4095。儀器定義沒有光源下的透光值為 0%,沒有檢測物的透光值為100%。則實際檢測中,檢測物的透光值均在 0%一100%之間。透光值
的計算如下:
T=(Meas—Min)/(Max—Min)
其中T為透光值, Meas為檢測的二進位數值, Min為在 0%的情況下檢測的二進位數值, Max為在100%的情況下檢測的二進位數值,舉例如下:
MaX=3600
Min=20
Meas=30
T=(30-20)/3600-20)=0.0028
OD=log(1/T)=log(1/0.0028)=2.552
中心定位
儀器會自動對酶標孔進行中心定位,中心定位是要消除酶標孔底的凸凹引起的厚薄不均帶來檢測的不準確。在對每一個酶標儀進行檢測時,儀器其實要進行35個點的測量,選取最中間的5個點的均值為本孔的OD值。
光源的參照通道
參照通道是用來校準由于電壓不穩或燈泡磨損帶來的影響。
用途和其它提示
用于ELISA試劑的測定,廣泛用于各種實驗室,包括臨床實驗室。
質量控制
質量控制是試劑檢測的重要因素。請按照試劑說明書的要求進行質量控制。
空白校正
有一些試劑盒的說明書將空白孔設置為空氣,其它大多數空白孔的設置是用試劑來設置的,請按照試劑盒的說明書要求進行。
檢測結果的解釋
由于有相當多的因素會影響檢測的結果,如不同的酶標板,檢測試劑的體積,都會造成OD值的不同,因此,只有使用同一酶標板反應的試劑檢測結果才能比較和分析。對結果的臨床解釋請依照試劑盒的說明書進行.
結構
規格有24孔板,48孔板,96孔板等多種,不同的儀器選用不同規格的孔板,對其可進行一孔一孔地檢測或一排一排地檢測.
酶標儀所用的單色光既可通過相干濾光片來獲得,也可用分光光度計相同的單色器來得到.在使用濾光片作濾波裝置時與普通比色計一樣,濾光片即可放在微孔板的前面,也可放在微孔板的后面,聚光鏡,光欄后到達反射鏡,經反射鏡作90°反射后垂直通過比色溶液,然后再經濾光片送到光電管.
從酶標儀工作框圖和光路圖上可看出,它和普通的光電比色計有以下幾點差異:
(l)盛裝待測比色液的容器不再使用比色皿,而是使用塑料微孔板.微孔板常用透明的聚乙烯材料制成,對抗原抗體有較強的吸附作用,故用它作為固相載體.
⑵由于盛樣本的塑料微孔板是多排多孔的,光線只能垂直穿過,因此酶標儀的光束都是垂直通過待測溶液和微孔板的,光束既可是從上到下,也可以是從下到上穿過比色液.
⑶酶標儀通常不僅用A,有時也使用光密度OD來表示吸光度.酶標儀可分為單通道和多通道2種類型,單通道又有自動和手動2種之分.自動型的儀器有X,Y方向的機械驅動機構,可將微孔板L的小孔一個個依次送入光束下面測試,手動型則靠手工移動微孔板來進行測量.
在單通道酶標儀的基礎上又發展了多通道酶標儀,此類酶標儀一般都是自動化型的.它沒有多個光束和多個光電檢測器,如 12個通道的儀器設有 12條光束或 12個光源,12個檢測器和12個放大器,在X方向的機械驅動裝置的作用下,樣品12個為一排被檢測.多通道酶標儀的檢測速度快,但其結構較復雜價格也較高.
用途
可廣泛應用于低紫外區的DNA、RNA定量及純度分析(A260/A280)和蛋白定量(A280/BCA/Braford/Lowry),酶活、酶動力學檢測,酶聯免疫測定(ELISAs),細胞增殖與毒性分析,細胞凋亡檢測(MTT),報告基因檢測及G蛋白偶聯受體分析(GPCR)等。
酶標儀(MicroplateReader)是對酶聯免疫檢測(EIA)實驗結果進行讀取和分析的專業儀器。酶聯免疫反應通過偶聯在抗原或抗體上的酶催化顯色底物進行的,反應結果以顏色顯示,通過顯色的深淺即吸光度值的大小就可以判斷標本中待測抗體或抗原的濃度。
酶標儀廣泛地應用在臨床檢驗、生物學研究、農業科學、食品和環境科學中,特別在近幾年中,由于大量的酶聯免疫檢測試劑盒的應用,使得酶標儀在生殖保健領域中應用越來越廣泛,同時促進了生殖健康技術水平提高。
目前國內許多計生站系統開展了酶免檢測項目,如:乙肝五項、艾滋病檢測、優生優育系列檢測、激素檢測等。過去多數采用目測方法,報出的結果缺乏科學的依據。例如:某弓形蟲檢測試劑盒中,臨界值規定為:陰性對照品的OD值×2.5,通過目測無法判斷標本孔的反應顏色是否超過臨界值。肉眼進行兩孔之間的顏色比較可能還行,但比較一孔的顏色是否超過另一孔顏色的2.5倍就不可能。
國內多家權威機構,如衛生部臨床檢驗中心和計劃生育系統等多次強調酶標儀的重要性,并要求酶聯免疫檢測試劑應使用酶標儀判讀,酶免試劑的質控也應使用酶標儀,并提供酶標儀測定的原始數據,而各廠家的試劑盒說明書沒有是讓用目測的。同時酶免檢測的項目往往是一些實質性的感染和病變(如:肝炎、艾滋病、優生優育等),判讀更要求嚴謹,由誤診引起的糾紛很難處理。另外,住院手術病人術前的丙肝、艾滋等EIA試劑檢測是避免因輸血引起感染引發的醫療事故糾紛的必要手段,正逐漸被許多單位所采用。