聽說隔壁實驗室買了一臺新成像，可以做Western Blot熒光掃描式Azure Sapphire成像，效果很好，操作也簡單，小師妹一臉羨慕，問了句，我從來沒做過熒光實驗，現在期刊雜志要求也在升級，也建議使用熒光的方法，之前因為沒有合適的儀器，所以不能嘗試，現在可以準備我的實驗了，那從化學到熒光Western Blot實驗，有哪些注意事項，或者哪些不同呢？
Azure Sapphire雙模式多光譜激光成像系統
實驗室大師兄這時候走過來，聽聽師兄給你的建議，以后要多看書，知道嗎？
一、增加濃度
與化學發光Western Blot相比，所需的一抗和二抗的濃度可能會增加，這也取決于您使用的成像儀系統。在激光成像器中，這種影響可能不太明顯。
二、首先進行單色實驗測試
首先單獨測試您的抗體非常有意義。這樣，您可以確定最佳濃度，在簡單的環境中可以把背景或非特異性的因素考慮進去，而不是一次性分析3種不同的一抗和二抗。
三、使用吸附性二抗
雖然聽起來很簡單，但許多人并不考慮，他們將多種抗體、多個物種加入到單一的印跡中。如果您在其他研究領域使用多重熒光，您可能已經意識到二抗的交叉吸附，減少物種間交叉反應性的重要性。但在Western中，很多人并不考慮，這是值得檢查的，以確保他們達到要求。
四、擴展光譜
三色Western Blot是令人興奮，那五種顏色呢？可以大大增加對不同波峰的區分。顯然，這可能需要一些工作進行抗體優化，一次用于5個蛋白的檢測可以節省時間和成本花費。
五、檢查印跡膜
盡管越來越多的熒光印跡膜正在開發中，但一些膜在UV光源暴露下發出自發熒光產生高背景信號。為了增加靈敏度，我們建議在做熒光Western Blot時使用低熒光的PVDF膜代替NC膜。
六、為蛋白選擇合適的通道
對于標準熒光，高豐度蛋白使用藍色通道進行檢測，中等豐度和低豐度蛋白分別使用綠色和紅色通道檢測。此外，使用激光NIR，可獲得極好的靈敏度和低背景，也是低豐度蛋白檢測的理想選擇。