密度梯度離心基礎知識（二）

（2）各種轉頭用于等密度離心的優缺點分析：
A、固定角式轉頭：主要用于差分離心的角式轉頭，在超速離心機上可以很好地用于等密度離心，尤其是 DNA平衡等密度離心，自形成梯度，用快速密封管或厚壁管，常用的單管的容量為 10~40ml。常用轉速 40,000~80,000rpm，離心時間較短，分離純度也較高。
B、甩平轉頭：用作等密度離心時，壁部效應對分離效果影響較小，梯度變換在甩平時自然過渡因而很適合做等密度離心實驗，優點是回收率高，分辨能力強。缺點是沉降距離長，最高轉速較低（由于結構原因此類轉頭最高轉速一般在 60,000rpm以上）因而，離心時間很長，對某些長離心管，10~15ml容量的轉頭最高速在 40,000~41,000rpm，用作自行成 CSCL梯度的質粒 DNA離心往往需要 50~70小時。
C、垂直管轉頭：適合作等密度離心，沉降距離最短，在沒有沉淀或沉淀非常堅實的情況下，對于現代可自由選擇加速、減速時間的離心機，梯度轉換得很好。這類轉頭轉速很高（目前最高轉速可達 100,000rpm，700,000×g）離心時間最短，分離純度高，樣品容量較大（垂直剖面積最大）。
D、近垂直轉頭：九十年代開始使用的新型轉頭，用作生物大分子（ DNA，RNA，蛋白質等）的平衡等密度離心最佳，目前這類轉頭的最高轉速已達 100,000rpm近750,000×g），離心時間比垂直轉頭稍長。
E、區帶轉頭：非常適合做大容量樣品的等密度離心。
F、連續流離心轉頭：高、低速連續流轉頭一般不用作密度梯度離心，超速連續流轉頭適合做大容量樣品的等密度離心分離。

三、密度梯度——材料和梯度型式的選用
1、對于速率-區帶密度梯度離心，梯度選擇要點
（1）概述：用速率-區帶法（Rate-Zonal，簡稱R-Z法）進行分離的主要原理是依靠不同樣品在梯度中沉降速率的不同來分離純化樣品，因此希望樣品沉降能通過整個離心管長度來提高分辨率。作為最基本條件就是梯度液的最大密度必須小于樣品顆粒的密度。
用有密度梯度的支持液作R-Z離心有以下優點：
●當樣品中不同組份分層進入梯度液時，梯度的較高密度支持著樣品，這樣就使混合樣品中各個不同密度的層次以較窄（或較薄）的區帶沉降從而得到較高的分辨率（或較高的純度）。
●梯度液的密度一般是從離心管上部到底部逐漸增加，這樣就可以穩定液柱，提高抗對流和抗機械擾動的能力（接近離心過程結束時，純樣品區帶和它的支持液的密度差較小）。
●梯度液粘性系數逐漸增大也使純樣品區帶變窄從而提示了分辨率。而逐漸減緩的沉降速度使同一組份樣品逐漸靠攏，提高了分離純度。

（2）梯度材料的選用
一個理想的梯度液應具備：化學穩定性好；高溶解度；低滲透性；在溶劑中的穩定性；較低的光吸收特性；低廉等。遺憾的是很難找到一種適合于各種 R-Z離心的完美無缺的梯度液。
對于大多數R-Z離心，蔗糖是比較合適的梯度材料。盡管它在高密度（40~60% W/ W）時粘性系數較大，但綜合比較表明它可以廣泛應用。但由于蔗糖在各種密度時（即使是低密度時也如此）有較高的滲透性，分離一些對滲透性敏感的生物體組份時需要選擇其他梯度材料，如由 Pharmacia公司開發的 Ficoll等等。
在大多數情況下，梯度液的 PH值應與被分離時生物制品的生理 PH值一致。
對密度梯度材料的基本要求：
（a）能夠配制所需要的密度范圍
（b）粘性系數較低
（c）溶解度高
（d）有密度與光折射率的對照資料
（e）對被分離樣品無損害
（f）對被分離樣品滲透很少
（g）在離心分離完成后很容易與生物樣品分離
（h）化學性能穩定
（i）對離心過程中所接觸的轉頭材料，離心管，管蓋及密封件，連續流及區帶轉頭的管道等等無腐蝕作用。
（j）純度高
（k）毒性少
（l）價格較低
（m）已知該材料的某些物理、化學、熱力學性能。
常用的梯度材料有：蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、酒石酸鉀、溴化鉀、碘化鉀、氯化銫、氯化銣、三氯醋銫、三氟醋酸銫、右旋糖苷、白蛋白、 Ficoll、Percoll、Metrizamide、 Nycodenz、Ludox、Dextran等等。
（3）梯度形狀的選擇
所謂梯度形狀是指梯度介質沿著離心管長度方向的密度變化特征。用于 R-Z離心密度梯度常用連續梯度也就是密度隨著離心半徑的增加而光滑地（不是突變地）增大，直線型的，光滑曲線型的（一般用凸指數或凹指數曲線，或凸凹指數曲線聯用的）都屬于連續梯度。不連續（階梯型）梯度多用于等密度離心。
●線性梯度：
在甩平轉頭中做 R-Z離心最常用線性梯度。
制備線性梯度時要注意：
在甩平或垂直轉頭中制備線性梯度時，梯度液面的密度必須足以支持樣品，而底部密度必須小于被分離樣品各個組份的密度。
一般地說較大的梯度斜率可以得到較高分辨率。
蔗糖的常用線性梯度范圍是 5~20%W/V或 10~40%W/V。
可以用梯度儀制備線性梯度，也可以人工鋪設數個階梯型梯度，離心管靜置一段時間后也可以形成近線性梯度。