寡核苷酸探針還有一個重要用途。在用于檢測單個堿基差異時尚可采用一種稱為寡核苷酸限制（oligonucleotiderestriction）的技術。
該技術只有在突變點位于某一限制性內切酶識別位點時才有效。例如，鐮刀狀紅細胞貧血是因β珠蛋白基因的第6個寡碼子由GAG變成GTG，從而導致所編碼氨基酸由酪氨酸變成纈氨酸。突變的β-珠蛋白功能異常，稱作S珠蛋白，而野生型稱為A珠蛋白，其基因型分別為βS和βA。恰好突變點A→T位于DelI的識別序列CT－NAG之內，這就為設計寡核苷酸限制實驗創造了條件。方法是合成一個長40個堿基的寡核苷酸探針，其5’末端距突變堿基有11個堿基，該探針與βA基因的非編碼鏈互補。將此探針的5’末端標記上32P。
雜交方法采用液相雜交法，即在液相中將靶DNA變性解鏈，然后與探針退火，產生雜交體。如靶DNA為βA型，則兩條鏈完全互補，并產生DdeI的酶切位點；如待檢DNA為βS型，則所形成的雜交體中兩條鏈在突變堿基處不配對，從而不能被DelI所識別。用DelI消化雜交DNA，顯然βA會被切開而βS不被切開。