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  • 發布時間:2019-08-02 10:43 原文鏈接: 對一些DNA提取方法的總結

    有時候提DNA不是很順,所以提出來大家討論一下,因為我是做微生物的,我首先提供一下關于微生物的DNA 提取方法,大家覺的有可以改進的地方,歡迎討論!!
    細菌DNA的提取:
    (一)
    試劑:
    1. 抽提緩沖液
    2% CTAB (W/V)
    2% PVP K25 (w/v) (去色素)
    100mM Tris-HCl (pH8.0)
    25mM EDTA (pH8.0)
    2.0M NaCl
    2.10M LiCl
    3. 2M LiCl
    4.DEPC-water(抑制RNA酶活性)
    5. 3M NaAc (pH5.2)
    6. 96% 乙醇
    7. 70% 乙醇
    步驟:
    1.抽提緩沖液65℃預熱;
    2. 加菌體到已經預熱的緩沖液(700ul)中混勻,65℃,10min;
    3. 加酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),振蕩,離心12,000rpm,10min;
    4.取上清,加氯仿/異戊醇(24:1)振蕩,離心12,000rpm,10min; 
    5. 取上清,重復4步驟;
    6. 加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇(或加入等體積的異丙醇),-20C沉淀;
    11. 離心12,000rpm,10min;
    12. 棄上清,70%乙醇洗,也可以再用100%乙醇洗,然后溶解于100ml 水中。
    (二)(我們常用的方法,但是有時有些細菌特別不好提,就用上面的方法)
    1. 將菌株接種于液體LB培養基,37℃震蕩培養過夜。
    2. 取1.5ml培養物12000rpm離心2min。
    3. 沉淀物加入567 ul的TE緩沖液,反復吹打使之重新懸浮,加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K,混勻,于37℃溫育1h.
    4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混勻,再加入80ul CTAB/NaCl溶液,混勻后再65℃溫育10min。
    5. 加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻,離心4-5min, 將上清轉入一只新管中,加入0.6-0.8倍體積的異丙醇,輕輕混合直到DNA沉淀下來,沉淀可稍加離心。
    6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后,離心棄乙醇.
    真菌DNA的提取:
    (一)
    1.取真菌菌絲0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
    2.加入4mL提取液,快速振蕩混勻
    3.加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1),渦旋3~5min(此處是粗提沒有加酚,可以節約成本的喲!)
    4.1000rpm,4℃,5min
    5.上清用體積的氯仿:異戊醇(24:1)再抽提一次(10,000 rpm,4℃離心5 min)
    6.取上清,加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約30 min
    7.用毛細玻棒挑出絮狀沉淀, 用75%乙醇反復漂洗數次, 再用無水乙醇漂洗1次, 吹干,重懸于500 &#61549;ulTE中

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