實驗概要
本實驗介紹了對流免疫電泳(counter immune electrophoresis)的原理及操作流程。
實驗原理
對流免疫電泳又叫反向免疫電泳或免疫電滲電泳。其原理為：在pH值8.6的瓊脂凝膠中，抗體球蛋白只帶有微弱的負電荷，而且它分子又較大，所以泳動慢，受電滲作用的影響也大，往往不能抵抗電滲作用，故在電泳時，反而向負極倒退。而一般抗原蛋白質常帶較強的負電荷，分子又較小，所以泳動快，雖然由于電滲作用泳動速度減慢，但仍能向正極泳動。如將抗原置陰極，抗體置陽極，電泳時，兩種成分相對泳動，一定時間后抗原和抗體將在兩孔之間相遇，并在比例適當的地方形成肉眼可見的沉淀線。這樣由于電泳的作用，不僅幫助抗體定向移動，因而加速了反應的出現，而且也限制了瓊脂擴散時，抗原抗體向四周自由擴散的傾向，因而也提高了敏感性，本法比瓊脂擴散法的靈敏度要高10～16倍。
實驗步驟
1. 制備瓊脂板：
1) 首先配制pH值8.6，μ=0.075的巴比妥緩沖液(配法：巴比妥鈉15.45g，巴比妥27.6g，蒸餾水加至1 000ml)。然后取優質瓊脂粉1～12g加到巴比妥緩沖液100ml中，配成巴比妥瓊脂；
2) 瓊脂板的大小可根據需要選擇，一般多用寬7(或5)cm，長12(或75)cm玻璃板，將其洗凈后，烘干。制板時，將上述瓊脂溶化，涼至56℃左右，用吸管吸取溶化瓊脂加在玻璃板上，使瓊脂厚3mm左右，待瓊脂凝固后打孔，孔的直徑3mm，兩行相距5mm，同一玻板放置兩排或三排抗原抗體對，每排間距26mm。
2. 加樣品：用滴管分別吸取抗原和抗體，直接加入瓊脂板的相應孔內。
3. 電泳：把加好樣品的瓊脂板放在電泳槽內，板的兩端用濾紙搭橋，與緩沖液相連，槽內裝的巴比妥緩沖液濃度可比瓊脂板中的高一倍或相同。電泳時，抗原端接負極(-)，抗體端接正極( )。
電泳時，通常以板的寬度計算電流，以板的長度計算電壓。可用5～6V/cm的電壓，2～4mA/cm電流，實際工作中，可根據具體條件靈活掌握，一般泳動時間為30～60min后，即可觀察結果，若沉淀線出現的不清晰，則可置于37℃溫箱或室溫(25℃)下再放數小時，效果會更好些。
4. 結果
通常于通電30～60min后，即可于兩孔之間出現沉淀線。如抗原量少，沉淀線不清晰，可把瓊脂板放在濕盒中，置37℃保溫數小時，沉淀線的清晰度有時可得以加強。
注意事項
1. 對流免疫電泳是根據抗體球蛋白在pH值8.6的瓊脂凝膠中只帶少量負電荷，在電泳過程中不能抵抗電滲作用，因而向陰極倒退；而一般抗原多數不是免疫球蛋白，它們帶負電荷多，電泳過程中抵抗電滲作用后，仍向陽極移動，因此，二者在兩孔間相遇處生成沉淀線的原理設計而成的一種免疫電泳。如果抗原抗體都是免疫球蛋白，或者它們的電泳遷移率非常接近，電泳時都向一個方向泳動，就不能作對流免疫電泳檢查。
2. 進行對流免疫電泳時，對所用瓊脂質量應嚴格掌握。試驗結果表明，電滲過大的西德進口瓊脂不適于作對流電泳用，而日本進口瓊脂及處理后的國產瓊脂，其性能均較好。瓊脂濃度要適當，濃度太高，可影響抗原抗體擴散速度；濃度低時，雖然抗原抗體擴散快些，但不易打孔和取出瓊脂塊，故以1%～12%的濃度較合適。
3. 抗原抗體比例適當，容易出現沉淀線，反之不易發生。
4. 電壓與電流低時，電泳時間需要長；電壓和電流加大時，電泳時間可縮短。但電壓過高則能使孔徑變形，甚至瓊脂溶化。