將基因轉移至未分化ES細胞實驗—將ES克隆挑取到96孔板

ES 生長培養基neoR-MEF 滋養板96 孔 U-底板無菌吸頭微量移液器

1. 準備下列試劑和材料：

ES 生長培養基，含 300 μg/ml G418 和青霉素/鏈霉素

96 孔平底 neo^R-MEF 滋養板

96 孔 U-底板

細而圓的無菌吸頭

微量移液器（10~100 μl）

8 道移液器

無菌多道移液器容器

2. 在有 neo^R-MEF 滋養層的平底 96 孔板的每孔中加 150 μl 含 G418 和青霉素/鏈霉素的 ES 培養基。置溫箱待用。

3. 在生物安全柜內的倒置顯微鏡下挑取克隆。

4. 用多道微量移液器在 96 孔 U 底板每孔加 25 μl 胰酶溶液。

5. PBS 沖洗含 ES 克隆的 100 mm 培養板兩次。加 PBS，恰好沒過培養板的底。

6. 在顯微鏡下，用裝有無菌超細吸頭的微量移液器挑取 ES 克隆。破壞 ES 克隆周圍的 MEF 細胞，將克隆吸入吸頭，體積不要超過 20 μl。

7. 克隆放入含胰酶的 96 孔培養板。

8. 多道移液器吹吸 4 次，分散 ES 細胞，轉移到從溫箱中取出的 96 孔 neo^R-MEF 滋養板，孵育過夜。

9. 第二天換含 G418 和青霉素/鏈霉素的 ES 生長培養基，繼續孵育。

10. 細胞培養 5 天左右傳代。每天更換含 G418 和青霉素/鏈霉素的培養基。