將基因轉移至未分化ES細胞實驗

DMSOPBS胰酶溶液凍存液

平底 96 孔板移液器ES 生長培養基ES 分化培養基

1. 準備下列試劑和材料：

DMSO（組織培養級）

平底 96 孔板

多道移液器

無菌多道移液器容器

ES 生長培養基

ES 分化培養基

無 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ PBS

胰酶溶液

2X 凍存液

2. PBS 沖洗 96 孔板上的 ES 細胞兩次，200 μl/孔。

3. 每孔中 40 μl 胰酶溶液，37℃ 孵育 5 分鐘。顯微鏡下觀察細胞脫落和分離情況。

4. 胰酶消化的同時，準備 2X 細胞凍存液（FCS+ 20% DMSO）。

5. 在胰酶消化細胞中加 60 μl 培養基，吹吸分散細胞。

6. 在新的無菌 96 孔板每孔中加 50 μl 2X 細胞凍存液。

7. 取 50 μl 胰酶消化的 ES 細胞，直接加入凍存液中，吹吸一次混勻。細胞轉移到 -80℃ 凍存，直至鑒定出具有預期表型的克隆。

8.  ES 分化培養基稀釋剩余細胞，懸滴培養。

9. 體外分化后，鑒定具有預期 lacZ 表型的克隆，融化相應的凍存細胞，用于進一步分析。