Hoxb5誘導的T細胞在功能上等同于野生型T細胞
好了，我們已經確定了Hoxb5確實在B細胞向T細胞轉化的過程中起關鍵的作用，那么我們得到再生的T細胞是否是有功能的呢？帶著這一問題，我們看看科研人員又做了哪些工作？
為了評估成熟再生的T細胞（iT）的功能，研究者將retro-Hoxb5 pro-pre-B細胞移植到經過亞致死輻射的（3.5Gy）Rag1-/-（C57BL/6背景，缺乏B細胞和T細胞）受體小鼠中。3周后能夠在Hoxb5-Rag1-/-小鼠PB中檢測到GFP+ iT淋巴細胞[圖6a]。將Hoxb5-Rag1-/-小鼠中GFP+脾細胞分離后，體外用CD3和CD28抗體培養6天，檢測到各細胞因子比例與野生型比較無差異[圖6b、c]。進一步異體皮膚移植模型證明，利用iT細胞重建的Rag1-/-小鼠，能夠排斥異體皮膚移植物（BALB/c 背景）。比如在移植部位形成的凸起，潰瘍和壞死病變 [圖6d] ，免疫熒光實驗結果顯示同種異體移植皮膚的真皮層能夠檢測到GFP+CD3+ iT淋巴細胞浸潤[圖6e]。
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iT細胞的功能是否包含獲得免疫記憶功能呢？研究人員在異種皮膚移植時隔8周后，對初次皮膚排斥反應的小鼠進行了二次異體皮膚移植。結果表明iT細胞產生了免疫記憶功能，能夠在更短地時間內發生免疫應答，排斥二次移植的異體皮膚組織[圖7a] 。流式分析排斥的皮膚組織制備的單細胞群發現排斥部位存在浸潤激活的CD44higCD69+的CD4+ SP和CD8 SP+ T細胞[圖7b] ，并且含有能夠分泌INFγ和IL-17的CD4+ SP，以及能夠分泌INFγ 的CD8+ SP T細胞[圖7c] 。因此，上述重編程再生的T細胞具備獲得性免疫記憶功能。
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B細胞重編程為T細胞過程中Hoxb5是瞬時表達的
當~當~當……
重點又來啦！！ Hoxb5確實指導了B細胞向T細胞重編程，并且再生的T細胞也具有功能。那么再生的T細胞是否依然需要Hoxb5的表達維持其生理功能呢？
為了研究這一機制，研究人員又構建了條件性誘導表達的Hoxb5小鼠模型(Tet-on Hoxb5-BFP) [圖8a]，此小鼠在用DOX誘導下能夠表達Hoxb5，停止飼喂DOX則關閉Hoxb5表達。在Tet-Hoxb5小鼠飲用水中添加DOX一周后，在小鼠BM中能檢測到BFP+ pro-pre-B細胞[圖8c] 。之后將BM BFP+ pro-pre-B細胞轉移到輻照過的NOD-SCID小鼠中（以下稱為Tet-Hoxb5-NOD-SCID小鼠）并持續飼喂DOX飲水。轉移后4,8和12周時檢測受體鼠在PB，LN，脾和胸腺都含有供體細胞來源的T細胞[圖8d、e]，在轉移后4周時檢測到超過95％的供體來源的T細胞是BFP-[圖8f]。如果Tet-Hoxb5-NOD-SCID小鼠連續喂DOX藥水兩周后停止喂藥[圖8b]，則4周后檢測發現PB和脾中的所有T淋巴細胞都是BFP- [圖8e] 。進一步分析發現BFP+細胞表達Hoxb5，而BFP-細胞與野生型一樣不表達Hoxb5 [圖8g] 。
這些結果證明體內2周的Hoxb5表達就可以成功地將B細胞重編程為T細胞，之后不再需要Hoxb5持續性表達來維持T淋巴細胞在胸腺的進一步發育成熟。單細胞測序分析表明上述重編程來源的T細胞都含有免疫球蛋白重鏈VDJ重排序列，證明起源于B細胞[數據不再展示]。
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