1.ACTH1～24興奮試驗 對于經典型21-羥化酶缺陷癥病人，根據臨床表現和基礎17-OHP，一般可以明確診斷。血清17-OHP基礎值不能提供足夠的診斷依據時，有必要進行ACTH1～24興奮試驗。一般而言60min時17-OHP水平在10ng/ml以上考慮非經典型21羥化酶缺陷癥的診斷。每個實驗室都應根據21羥化酶缺陷癥雜合子攜帶者和正常人確定出自己的診斷標準。
對于新生兒。如果根據外生殖器兩性畸形懷疑CAH，ACTH1～24興奮試驗必須推遲到出生24h后進行。如果在出生后馬上取標本則會有較高的假陽性率和假陰性率。
ACTH1～24興奮試驗還有助于鑒別診斷。在其他酶缺陷的CAH病人中17-OHP也會升高，如11β-羥化酶缺陷癥或3β-羥類固醇脫氫酶缺陷癥。為了鑒別各種酶缺陷，最好的方法是在0，60min檢測17-OHP，DOC，皮質醇及11-脫氧皮質醇、17-羥孕烯醇酮、DHEA和雄烯二酮。如果是幼小的嬰兒，采血量是個問題，則可以只在60min時取血。前體物質與產物的比值對鑒別各種酶缺陷尤為有用。如果診斷仍不明確，應該對患者進行試驗性治療，然后在糖皮質激素部分減量或完全終止后再次檢查。
2.失鹽的檢查 PRA(血漿腎素活性)值升高，特別是PRA與24h尿醛固酮比值增加標志著醛固酮合成障礙。在循環血中ACTH，17-0HP和孕酮水平高，但醛固酮水平正常的病人中這些指標也會升高，這樣沒有很好控制的單純男性化病人生化表現會與失鹽型混淆。鹽皮質激素治療可以對這些病人腎上腺抑制，有助于二者的鑒別。理想狀態下，血漿和尿醛固酮水平應該與PRA和鈉平衡相關，從而有助于對臨床類型的準確判斷。在分析腎素水平的意義時，必須注意新生兒正常值高于年齡較大的兒童。
3.用于診斷和監測21-羥化酶缺陷癥的其他激素 其他一些生化診斷實驗可供考慮，但目前很少能廣泛開展。21-脫氧皮質醇能夠檢測出超過90%的CAH攜帶者。雄激素代謝物(3α-雄烷二醇葡萄糖苷酸)的水平在非經典型21-羥化酶缺陷癥病人中升高，與雄烯二酮和睪酮水平高度相關。17-OHP尿中的主要代謝物孕三醇也可用于21-羥化酶缺陷癥的診斷。另外，尿孕三醇葡萄糖苷酸可以用于監測治療效果和是否治療過度。作為酶聯免疫分析或RIA的代替方法，尿類固醇代謝物可以通過GS/MS方法檢測，這種方法可以使CAH和其他類固醇代謝疾病相關指標同時得到檢測。