1.新生兒篩查
苯丙酮尿癥的新生兒篩查已逐步成為常規新生兒篩查，即是通過測定血苯丙氨酸在群體中對每個新生兒進行篩檢，使PKU患兒在臨床癥狀尚未出現之前，而其生化等方面的改變已比較明顯時，得以早期診斷早期治療避免智能落后的發生。
2.尿三氯化鐵（FeCl3）及2，4-二硝基苯肼試驗（DNPH）
（1）三氯化鐵（FeCl3）試驗 在新鮮尿液5ml加入0.5ml的FeCl3尿呈綠色為陽性。
（2）2，4-二硝基苯肼試驗 在1ml尿液中加入1ml的DNPH試劑尿液呈黃色熒光反應為陽性。
這兩種試驗陽性反應也可見于楓糖尿癥胱氨酸血癥，需進一步做血苯丙氨酸測定才能確診。
3.血苯丙氨酸測定
有兩種方法：
（1）Guthrie細菌抑制法 正常濃度<120μmol pku="">1200μmol/L
（2）苯丙氨酸熒光定量法 正常值同細菌抑制法。
4.苯丙氨酸負荷試驗
對血苯丙氨酸濃度大于正常濃度且<1200μmol>1200μmol/L診斷為PKU，<1200μmol/L為高苯丙氨酸血癥。
5.HPLC尿蝶呤圖譜分析
10ml晨尿加入0.2g維生素C酸化尿液后，用8cm×10cm新生兒篩查濾紙浸濕晾干寄送有條件的實驗室，分析尿蝶呤圖譜，進行四氫生物蝶呤缺乏癥的診斷和鑒別診斷。
6.口服四氫生物蝶呤負荷試驗。
7.腦電圖。
8.CT和MRI檢查。
9.智力測定評估智能發育程度。