小分子蛋白Westernblot檢測

發布時間：2019-04-17 19:04 原文鏈接：小分子蛋白Westernblot檢測

實驗概要

1.目的檢測小分子蛋白抗體

2．

3．適用范圍單克隆抗體和多克隆抗體

實驗原理

將經電泳分離的抗原轉印到膜上作為固相,利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相抗原結合的受檢抗體

主要試劑

試劑配制

4.1.1 40% Bis-acrylamide with 2.6% C （Acrylamide:Bis, 38.95:1.05）

丙烯酰胺 77.9g

雙甲叉丙烯酰胺 2.1g

Total 200ml

4.1.2 30%膠溶液:

0.8 雙甲叉丙烯酰胺 0.8g

29.2% 丙烯酰胺 29.2g

total 100ml

4.1.3 3M TrisHCl , pH 8.45

36.3g Trisbase

Total 100ml

4.1.4 WG ( water Glycerol):

Water: 58ml

Glycerol: 36ml

Total: 94ml

4.1.5 10x Electrophoresis Buffer stock pH8.3 （to make the working buffer, just dilute 10 times. Do not adjust pH , pH should be 8.3.）

Trisbase 60.5g

Tricine 89.5g

SDS 5g

total 500ml

4.1.6 10% SDS

SDS 10g

Total 100ml

4.1.7 2x Laemmli Stacking Buffer pH6.8:

0.25M Tris 15.14g

0.2% SDS 1g or 5ml 20% SDS

total 500ml

4.1.8 5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7:

Stock: to use:

20% Glycerol 100ml take 9.5ml stock

10% SDS 50g or 250ml 20% SDS add BME 0.5ml

250mM Tris 15.14g bromphenol blue or

total 475.00ml pyronine 4 to taste

4.1.9 transfer buffer

48mM Tris base 5.81g

39mM Glycine 2.93g

0.037% SDS 0.375g or 1.875ml of 20% SDS

40% MeOH 400ml

total 1000ml

4.1.10 TBST

10mM Tris-HCl, pH7.4

100mM NaCl

0.2% Tween-20

Total 1000ml

4.1.11 稀釋液 TBST 5% 脫脂奶粉

4.1.12 ECL底物溶液 A液1ml B液1ml，臨用時配制

4.1.13 DAB底物溶液

DAB(3,3二氨基聯苯胺) 50mg

0.05mol/L Tris-Base（PH7.6） 100ml

先配成2-5倍的儲存液，過濾后分裝，-20℃避光保存，使用稀釋，臨用時加入30%H2O2，在工作液中終濃度0.01％

4.1.14 PSQ膜

4.1.15 甲醇

4.1.16 顯影液

4.1.17 定影液

4.1.18 X光膠片

主要設備

電泳儀

實驗材料

分離膠、間隙膠及濃縮膠配方比例

分離膠配方： 15%

Separating Gel (15%)	1塊膠
WG	1.88ml
40％ Gel.sol	2 ml
3M TrisHCl pH 8.45	2 ml
10% SDS	0.06 ml
10%APS	0.06 ml
TEMED	0.003 ml
Total	6.003 ml

間隙膠配方： 10%

Spacer Gel (10%)	1塊膠
dH2O	0.47 ml
30％ Gel.sol	0.5 ml
3M TrisHCl pH 8.45	0.5 ml
10% SDS	0.015 ml
10%APS	0.015 ml
TEMED	0.0015 ml
Total	1.5015 ml

濃縮膠配方：4%

Stacking Gel (4%)	1塊膠
2×Stacking. buffer	1.5ml
30％ Gel.sol	0.75ml
ddH2O	0.75ml
TEMED	4ul
10%APS	40ul
Total	3.44ml

感謝您對labfere的關注，祝您實驗順利

實驗步驟

操作步驟

4.2.1 Tricine-SDS-PAGE（分離膠、間隙膠、濃縮膠配方參見附錄）

4.2.1.1 做分離膠，加水封膠，待其凝固。

4.2.1.2 做間隙膠，加水封膠，待其凝固。
4.2.1.3 做濃縮膠，插梳子。

4.2.1.4  待濃縮膠凝固后，拔掉梳子，并將架子轉移到電泳槽中，先在中部加入1x Electrophoresis Buffer  pH8.3，點樣。
4.2.1.5  調節電壓到60v,開始電泳，一小時后電壓升至120v。
4.2.1.6  溴酚藍開始跑出最下端時停止電泳

4.2.2電轉印
4.2.2.1 將PSQ膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再用transfer buffer浸泡，同時將濾紙浸泡入transfer buffer 中.

4.2.2.2 轉移。在電轉移儀上鋪好濾紙，膜和膠，如圖。濾紙一般用三層，濾紙和膜、膜和膠之間一定不能有氣泡。裝好電轉移儀, 根據需要選定所需的電流。轉移時間一般為2.5 小時,( 1mA-2mA/cm2, 10% gel), 可根據分子量大小調整轉移時間和電流大小.轉移過程中隨時觀察電壓的變化,如有異常應及時調整

4.2.3 免疫印跡

4.2.3.1 轉移結束后，將膜放入稀釋液中封閉，4℃孵育16小時或室溫孵育1小時

4.2.3.2 按需求稀釋一抗，加在膜上相應的位置，室溫孵育1小時

4.2.3.3 用 TBST洗三次,每次5min

4.2.3.4 加酶標二抗，室溫孵育1 小時. 一般采用HRP標記的二抗, 稀釋比例為1:5000（參考：一張膜，10ml 牛奶 2ul二抗，兩張膜，20 ml 牛奶4ul二抗）

4.2.3.5 用TBST洗三次,每次5min

4.2.3.6 顯影。在暗室里，將PSQ膜泡在ECL底物溶液1分鐘左右(一般每張膜,用1.6ml-2.0ml的反應底物)，然后用保鮮膜將PSQ膜包好，放入暗盒；關掉日光燈，打開紅外燈，取出膠片，折左上角作記號，鋪到膜上，夾好暗盒；1分鐘后取出膠片，放入顯影液中，輕輕振蕩，3分鐘后取出，清水洗滌一次，放入定影液中，輕輕振蕩，3分鐘后觀察結果，并根據第一張的曝光情況，調整下面膠片的曝光時間和曝光區域

4.2.3.7顯影完后收拾好暗室的物品，帶膠片離開

4.2.3.8 也可用DAB底物溶液顯色