小膠質細胞原代培養

實驗方法原理 利用混合膠質細胞培養物分層生長，以及小膠質細胞半懸浮生長的原理，通過搖床震蕩法，將皮層來源的混合膠質細胞培養物最上層的小膠質細胞震搖下來繼續培養，達到分離和純化小膠質細胞的目的。

實驗材料 新生1-3d的仔鼠

試劑、試劑盒 含10%胎牛血清的DMEM培養基D-PBS液消化液(0.25%胰蛋白酶+0.04%的EDTA)

儀器、耗材 37℃恒溫搖床

實驗步驟

1按照培養少突膠質細胞的方法，待10d后細胞分層生長。顯微鏡下可見滿視野圓形、折光性強的小膠質細胞，附著在貼壁生長、緊密連接在一起、鋪滿培養瓶的星形膠質細胞層上面，甚至可見許多圓形小膠質細胞飄落在培養液中，此時可以開始純化。

2.將培養瓶固定到37℃恒溫搖床上，80-200r/min,振搖2h左右。

3收集振搖下來的小膠質細胞，種植到多聚賴氨酸包被的培養皿中，加入新的含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養，每2-3d換液1次。

4.小膠質細胞在體外較難進一步分裂增殖，但如果根據實驗需要傳代培養，一種方法可以直接用細胞刮子刮下細胞，接種到新的培養皿中；另一種方法就是用0.25%胰酶+0.04%的EDTA消化后，進行傳代。此方法獲得的小膠質細胞，純度可達90%-95%以上，可以用小膠質細胞特異性標志物F4/80、IBA1和IB4等進行免疫細胞化學染色進行鑒定。相差顯微鏡下觀察，靜息狀態的小膠質細胞形態呈短小桿狀或細長梭形等形態，帶有2個或以上突起，折光性強，但是在激活和發揮吞噬功能狀態下，小膠質細胞形態可發生巨大變化，胞體變大、變長或者變圓（圖I--5)。

注意事項

1.所有步驟要無菌操作．否則小膠質細胞有被污染或被微生物及毒素激活的可能。

2在振搖細胞之前，一定要確保底層的星形膠質細胞鋪滿培養瓶，并緊密連在一起，否則振搖過程中會將星形膠質細胞層搖起。

其他

1.振搖分離出小膠質細胞后，將新的培養液加入原培養瓶中繼續培養，數天后又會出現大量的小膠質細胞，如此可以重復甚至更多次振搖收集小膠質細胞。

2.由于小膠質細胞數目所占比例較小，在體外較難分裂增殖，故其產最不高。有文獻報道可以采用營養缺失法或加入單核細胞集落刺激因子(M-CSF)以增加產量。作者在培養過程中加入了15%-30%L929條件性培養基。L929是一種成纖維細胞系，由于其分泌M-CSF,結果可獲得充足的小膠質細胞。