小麥總RNA的提取

實驗概要

從黃化小麥苗中提取總RNA，可以為cDNA文庫的構建做好準備。

實驗步驟

1. 所有容器高溫滅菌兩次，DEPC高溫滅菌，所有的試劑用DEPC配制，高溫滅菌。

2. 在一滅菌2mL管中加入：5mol/L異硫氰酸胍0.7mL、苯酚0.4mL、NaAc(pH4.0) 0.1mL。

3. 稱取0.2g小麥黃化苗的葉片，迅速在液氮中研磨成粉末，轉入已準備好的離心管中，劇烈震蕩。

4. 混勻，冰浴30min。

5. 4℃，12000rpm，10min。

6. 上清至另一離心管中加0.4mL氯仿，劇烈震蕩。冰浴放置5min。

7. 4℃，12000rpm，10min。

8. 棄有機相(下層) 加入0.4mL氯仿和0.4mL酚，室溫放置5min。

9. 4℃，12000rpm，10min，棄有機相，加入等體積異丙醇。-20℃放置1h。

10. 4℃，12000rpm，10min，沉淀用70%乙醇洗兩次。

11. 室溫稍干燥。

12. 沉淀加20μLDEPC水溶解(-20℃保存)

13. RNA電泳：1％瓊脂糖膠20mL，8μL樣品，1μL樣品緩沖液，1μLSYBR，100V恒壓電泳，測OD260和OD260／OD280。

注意事項

1. 步驟1目的是去除RNA酶(外源)的影響。高溫滅菌兩次可以破壞RNA酶的復性過程，雖然RNA酶極易復性，但兩次連續的高溫會打亂它的復性歷程，從而使RNA酶失活。 DEPC是RNA酶的非競爭性抑制劑。DEPC可以與RNA酶的活性中心的組氨酸咪脞環上的N結合，從而使RNA酶失活。因為DEPC能與RNA的N結合，從而修飾RNA，所以必須將DEPC最終除去。在高溫滅菌時，DEPC因高溫分解而揮發。UV也能修飾RNA，實驗時應避免。DEPC滅菌后稱為DEPC水，它是不含DEPC的。實驗過程中要勤換手套，必要時要在超凈工作臺中進行。

2. 必須提前準備好變性劑。異硫氰酸胍可以變性RNA酶，也可以破細胞。本試驗不可以用酶法破細胞。因為蛋白酶K的適合的條件也可以使RNA酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA在有機相(酚相)中，而在堿性條件下，DNA和RNA都在水相中，無法分離。苯酚用于抽提DNA和蛋白質。

3. 低溫防止內源性RNA酶降解RNA。劇烈震蕩是使所有的細胞散開，浸在變性劑中。低溫的細胞在相對高溫的液體中是會形成一團，這樣就會使內部的RNA沒有水解RNA的機會。小麥的黃化苗因為沒有光合作用，所以含糖少，易于抽提。

4. 步驟6目的是去除脂類。

5. 步驟8目的是去除脂類和蛋白質。

6. 步驟9目的是去除糖，脫水，因為體系高鹽(2mol/L NaAc)，所以可以使RNA沉淀。

7. 步驟10注意因為提出的量很少，可能不可見，所以離心要有方向標記。

8. RNA是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。若不溶解是因為有太多的糖的殘余。

9. DEPC水中應不含RNA酶。