實驗材料
| 試劑、試劑盒 | |
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| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 一、材料 1. 植物材料 Crocus 或 Chinese Spring 小麥種子由美國農業部國家種質資源信息中心提供 （http: // www . ars- grin . gov / npgs /)。Crocus 為紅色硬粒加拿大春小麥種 質系 [ 7 ] ，Chinese Spring 小麥常用于遺傳學研究（見注
2)。 2. 生長設施 (1) 一個溫控溫室或走入式生長箱 (2) 標準化盆栽基質，如泥炭土 2 號（Fafard #2) (Knoxville Seed and Greenhouse) (3) 通用型奧綠肥 14-14-14 (Osmocote) (Hummert International) (4) 6 in（1 in = 0.0254 m，后同）塑料盆 3. 農桿菌的培養 (1) 利用標準電激轉化法獲得的甘油凍存農桿菌單克隆，攜帶具有 pBECKSred 質粒載體的 AGL1 或 C58C1 農桿菌菌株 [ 8，9 ] （見注 3) 。 (3) LB 瓊脂平板 [ LB 固體培養基：12 g/L 的瓊脂粉（Fisher) ，50 μg/ml 壯觀霉素， 50 μg/ml 利福平 ]。 (4) YEP 固體培養基：20 g/L 胰蛋白胨，10 g/L 酵母粉，50 μg/ml 壯觀霉素，50 μg/ml 利福平，200 μmol/L 乙酰丁香酮（3'，5'-二甲氧基-4'-羥基苯乙酮）。乙酰丁香酮溶解于二甲基亞砜中（DMSO) 。 (1) 1/2 MS 培養基（Fisher Biotech) [10]：pH 5.8，5% 蔗糖（m/V），0.04% Silwet L-77（V/V）， 0.5 mmol/L MES（2-N-嗎啉代乙磺酸），200 μmol/L 的乙酰丁香酮（見注 4) [ 11，12]。 (3) 小且干凈的塑料包裝袋和用于授粉的玻璃紙袋。 (4) 小剪刀和小鑷子。 5. 篩選 (1) 解剖鏡 (2) 商用漂白劑（30%）；1000 ppm（1 ppm =10-6，后同）的頭孢霉素（Fisher) 備用 [13 ]。 (3) 噴霧用 2% 巴龍霉素（m/F，Fisher) ，內含 0.2%（V/V）表面活性劑吐溫 20 [14]。 (4) NPTII ELISA 檢測（酶聯免疫法）試劑盒（Agdia, Inc， Indiana) 和讀數可調在 540 nm 波長的酶標儀一臺。 見 第 13 章。 二、方法 1. 小麥的生長條件 (1) 小麥生長的環境溫度（溫室或氣候箱內）不要超過 25℃。最理想的白天溫度為 21~25℃， 夜間溫度為 16°C，且保持 16 h 的光照。 (2) 將含有通用型奧綠肥（Osmocote 14-14-14) 的泥炭土基質（Fafart # 2 ) 培養基裝入 6 in 盆中，穴播播種小麥種子。必要時，在基質中再加入其他營養素。 (4) 在利用農桿菌浸染小麥花器官轉化前一次性澆透水，在農桿菌轉化處理后 2 天內不能再次澆水。 2. 農桿菌的培養和 Vir 基因的誘導 (1) 將攜帶質粒的農桿菌株系（甘油凍存）接種至 5 ml 的 LB 培養基中，加入適當的抗生素，以 約 160 r/min 的轉速在（22±2 )℃ 條件下培養過夜。 (2) 第 2 天，取 2.5 ml 搖好的新鮮菌液接種于 250 ml YEP 培養基中（含抗生素和 200 μmol/L 的乙酰丁香酮），以 160 r/min 的轉速在（22±4 )℃ 條件下培養至光密度為 1.0（OD600）。 在室溫條件下，將含有 YEP/農桿菌的培養基以 6000 r/min 的轉速離心 15 min，隨后棄掉上清液 輕輕重懸農桿菌到最終濃度 1.0（OD600），處理待轉化植株前，再將 Silwet-77 添加至滲透培養基中。 (1) 選擇孕穗期麥穗（單核小孢子發育的前期、中期和晚期）用于轉化。此時的小麥麥穗依然包裹在葉 鞘中，長 6~7 cm ( 圖 6.1，見注 5 ) 。 (2) 打開葉鞘顯露出正在發育的麥穗，其頂端和內部的花由于不育率比較高，可以去掉，也可以保留。 其余的花在穎包頂端略下部剪口。 (4) 用透明的小塑料袋把浸泡后的麥穗套起來，確保塑料袋在 2 天內能夠保持較高的濕度。 (5) 去掉塑料袋，讓麥穗恢復正常生長。晾干農桿菌處理過的麥穗，由于植物已接近開花期，要用玻 璃紙袋覆蓋麥穗以防止麥株之間的交叉授粉，并讓代種子自然結實（見注 7) 。  5. 篩選 在用 Southern 雜交鑒定拷貝數、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT- PCR) 或 Northern 雜交檢測目的 基因的表達等費時費力的轉基因檢測方法之前，先用一套簡便的方法進行篩選。 (1) 在體式鏡下觀察，以野生型為對照，篩選胚為紅色的代種子（圖 6.2 , 見注 8) 。 (2) 選定的轉基因種子在 30% 商用漂白粉溶液中搖動并清洗 30 min，以殺死殘留的農桿菌，再用 滅菌水沖洗 3 次，每次搖動清洗 5 min，隨后播種于基質中。 (3) 可選程序：在室溫條件下，用 1000 ppm 濃度的頭孢霉素處理萌發的轉基因苗（步驟 1 的可 選程序——第 3.6 節）2 h 以殺死殘留的農桿菌 [13]。  7. 在整株水平上，利用 2% 巴龍霉素進行抗性篩選 (1) 待轉基因苗和野生型植株長至 3~4 葉期時，噴灑 2%（m/V）的巴龍霉素 [ 含 0.2%（V/V） 的吐溫表面活性劑 ] [14]。 (2) 待植株繼續生長 5~7 天后，分別對抗性和敏感株系進行統計（見注 9 ) ，選擇并保留抗性 株作為潛在的轉基因陽性株。 (1) 參考 NPTII ELISA 酶聯免疫操作手冊（Agdia Inc.) 。 (2) 非常重要的一點是，用野生型對照植物的蛋白提取液溶解試劑盒中的 NPTII 標準樣品。 (3) 為了避免假陽性，盡可能選擇一個以上的野生型植株作為陰性對照（見注10）。 (4) 選取轉基因植株的健康組織，添加 Agdia 蛋白提取液，用微離心管提取并濃縮蛋白質樣品（ 組織質量：緩沖液體積=1 : 5 ) 。用 1 ml 的槍頭浸沒植物組織，再用杵碾磨，離心 5~10 min （約 12000 r/min 的轉速），取上清液保存備用。以上實驗過程均在 4°C 條件下操作。 (6) 檢測結束后，加入 3 mol/L 的 H2SO4 以終止反應，然后在酶標儀上選擇 450 nm 波長進行 定量檢測。ELISA 讀數普遍高于野生型的單株可以初步判斷為陽性轉化株。 分別提取轉基因植株、野生型對照和質粒基因組 DNA，待 DNA 酶解消化完全后，經瓊脂糖凝膠電泳 對酶切片段進行分離、轉膜，最后用目的基因的互補探針進行雜交檢測。見第 13 章。 |