實驗概要
學習和掌握DNA的微量提取法。
實驗原理
小麥黃化苗經液氮研磨，可使細胞壁破裂，加入去污劑（如SDS），可使核蛋白體解析，然后使蛋白和多糖雜質沉淀，DNA進入水相，再用酚、氯仿抽提純化。本實驗采用SDS法，其主要作用是破膜。SDS屬陰離子去污劑，要溶解膜蛋白與脂肪，也可解聚核蛋白。SDS在溶液中帶負電荷，能與帶正電荷的蛋白質側鏈結合成復合物，當加入鉀鹽時，能與SDS－蛋白質生成溶解度很小的沉淀一同去除。酚/氯仿/異戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白質，并有利于水相與有機相的分開，而且可以消除泡沫。異丙醇或乙醇的作用是沉淀DNA。
處理DNA樣品時，可在65℃保溫30min，較之37℃處理有以下優點：RNA酶的最適作用溫度為65℃；DNA酶最適作用溫度為37℃，當用65℃處理時，這些酶往往處于活性極低的狀態而不會降解DNA；RNA中的某些總分會形成發卡結構，65℃處理更有利于這些結構的松散，使RNA酶的作用更完全。
主要試劑
1. 提取緩沖液
100mmo/L NaCl
100mmol/L Tris-Cl（pH8.0）
50mmol/L EDTA
1%疏基乙醇
2. 20％SDS
3. 5mol/L醋酸鉀
取29.5ml冰醋酸，用KOH顆粒調校至PH4.8，加水至100ml，室溫保存，不可滅菌。
4. 酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）
5. 異丙醇
6. 70％乙醇
主要設備
1. 冰盤（4個）
2. 研缽（8套）
3. 塑料燒杯（8個）
4. 200μl微量加樣器（2把）
5. 離心機（1臺）
6. 水浴鍋（65℃）
7. 槍頭及EP管
實驗材料
小麥黃花苗
實驗步驟
1. 稱取0.1g小麥黃化苗葉片于預冷的研缽中，加入3倍體積(W/V，約300μl) 提取緩沖液，在冰盤上研磨。
2. 研碎后轉入一EP管中，再加約300μl提取緩沖液。
3. 加入20％SDS至終濃度為2％，約 66μl。
4. 輕輕混勻后于65℃水浴，10min。
5. 加入1/10體積的5mol/L醋酸鉀(約66μl)，于水浴中反應 30min。
6. 離心（15krpm，10min，4℃）。
7. 取上相轉入一新的EP管中，用等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）抽提一次（上下晃動幾次即可）。
8. 離心（12krpm，10min，20℃）。
9. 取上相轉入一新的EP管中，加入等體積的異丙醇，于室溫下反應5~10min，其間將管至少顛倒5次。
10. 離心（15krpm，10min，4℃）。
11. 棄上清液，用70％乙醇沖洗沉淀物，真空抽干或吹干，最后溶于1×TE中（約50μl）。
注意事項
1. 研磨后應迅速加入提取液，因為提取液中含EDTA，能夠螯合Mg2 等二價陽離子，防止破碎細胞中的DNA酶降解DNA。
2. 提取過程中，轉移上清液時所用的槍頭最好用剪刀將尖頭剪去，以避免對DNA造成的不必要的機械損傷。
3. 干燥DNA時，要注意，過干或過濕都不利于DNA的溶解。