（2）質粒的提取及酶切鑒定分析
質粒的提取按照質粒提取試劑盒的操作步驟進行，然后進行雙酶切鑒定。
| 管號 | ① | ② |
| 質粒DNA | 10μl | 10μl |
| BamHⅠ | 1μl | 0μl |
| BamHⅠ Buffer（10×） | 2μl | 2μl |
| SalⅠ | 2μl | 0μl |
| ddH2O | 5μl | 8μl |
加樣后混勻，置于37℃水浴中，保溫3~4h。然后每個管中加入4μl Loading buffer終止反應，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
Southern 雜交
實驗目的：學習通過Southern 雜交鑒定目的基因的方法
實驗原理：將DNA經限制性內切酶消化成一系列片段，進行瓊脂糖凝膠電泳，各片段因分子量不同而彼此分開，然后經堿處理凝膠，使DNA的片段被變性、中和并通過毛細作用在高鹽緩沖液中在原位將單鏈核酸轉印到硝酸纖維膜上，烘干、固定。然后用被標記的探針與其雜交，再通過顯影技術觀察雜交結果。
實驗步驟：
（1）探針的標記
① 用滅菌去離子水稀釋1μg DNA至總體積16μl。
② DNA熱變性： DNA沸水浴10min，然后迅速插入碎冰中3min以上。
③ 加4μl DIG Random Labeling Mix（高效），混勻后2000rmp離心5min。
④ 置于37℃反應至少120min。時間越長，產量越高。延長反應時間至20h可明顯增加地高辛標記DNA的產量。應根據需要控制反應時間。
⑤ 加入2μl EDTA以終止反應，-20℃保存。
（2）Southern轉移
① 將目的基因經瓊脂糖凝膠電泳的膠板從電泳槽中取出，用蒸餾水漂洗20～30min。
② 把凝膠浸入變性液中，室溫浸泡15min×2次。
③ 蒸餾水漂洗凝膠2次。
④ 把凝膠浸入中和液中，室溫泡15min×2次。
⑤ 處理凝膠的同時，切一張同樣大小的尼龍膜或者硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜用2×SSC浸泡。剪兩張Whatman 3mm濾紙（或相當的）和吸水用的粗濾紙。注意不要用手直接觸及膜面。
⑥ 準備轉移用平盤和支架，平盤中放20×SSC，支架上搭濾紙橋，依次放置：濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、濾紙、吸水紙和玻璃板。在玻璃板上壓一500～1000g的重物。
⑦ 室溫下轉移12～20h。
⑧ 取出轉移膜，用2×SSC漂洗數次，以去除可能吸附在膜上的凝膠。
⑨硝酸纖維素膜置于普通烘箱中80℃烘烤2h進行固定。
（3） Southern雜交
① 將轉移好的尼龍膜或硝酸纖維素膜裝入雜交管中，貼壁放置（吸附有核酸的一面不要貼壁），趕走雜交膜和管壁間的氣泡。
② 加入20ml 預雜交液，65℃預雜交4～20h。
③ 將制備的DNA探針沸水浴加熱10min，然后迅速插入冰中，全部加入雜交管。
④ 使用和預雜交相同的雜交溫度，一般雜交16～20h。
⑤ 雜交結束后將雜交液倒入帶蓋的試管中，儲存于-20℃以備下次使用。這樣至少可以保存一年。再次使用前，應在凍融后加熱至95℃使探針10min變性。
⑥ 取出雜交膜，用Wash SolutionⅠ洗3次膜，每次5min。
⑦ 保溫沖洗：用 Wash SolutionⅡ于68℃沖洗2次膜，每次15min。
（4） BCIP/NBT 顯色檢測法
① 經過雜交及雜交后的沖洗之后，膜置于沖洗液中平衡1min。
② 用干凈的平皿，封閉液室溫封閉至少60min。
③ 用封閉液1：2500～5000稀釋 Anti-DIG-AP，例如2μl Anti-DIG-AP加至5～10ml封閉液中（根據染色情況而調整）。稀釋液4℃可穩定12h左右。
④ 加Anti-DIG-AP，37℃反應60min。
⑤ 分別用100ml沖洗液洗3次膜，每次15min。
⑥ 按1：50配制底物顯色液：例如100μl “BCIP/NBT儲備液”加至5ml顯色緩沖液中，未用完的顯色劑應避光保存。
⑦ 用20ml顯色緩沖液將膜平衡2min后取出。
⑧ 在平皿或雜交袋中加10ml底物顯色液（6×6cm），將膜浸入顯色劑中避光顯色。顯色過程中可以觀察，一般數分鐘即開始出現顏色，顯色過程可以持續至12h。應絕對避免震動，以免出現顏色帶的移位。
⑨ 當所需要的顯色點或帶出現之后，蒸餾水洗以終止反應。結果可以進行照相記錄；也可以直接保存于TE緩沖液，在此情況下，顏色長期不退。還有一種選擇是讓膜干燥，顏色消褪。但若將膜放置于TE緩沖液中，顯色重新出現。
（5）結果分析
具體分析Southern雜交結果。
目的基因誘導表達和蛋白分離純化
實驗目的：掌握目的基因誘導表達和目的蛋白分離純化的原理和方法
實驗原理：
pGEX-4T-1上攜帶的是trp-lac啟動子，亦稱tac啟動子。它是一個雙啟動子，或稱雜合啟動子。tac
啟動子是一組由lac和trp啟動子人工構建的雜合啟動子。由trp啟動子加上lac操縱子中的操縱基因、SD順序融合而成。整個tac啟動子受lac阻抑物調控，在lac阻抑物高水平表達的lacl大腸桿菌菌株中，其轉錄可被抑制，加入異丙基硫代半乳糖苷(1PTG)可誘導其表達。
經誘導表達的蛋白是包括谷光甘肽巰基轉移酶（GST）和目的蛋白的融合蛋白，將粗蛋白通過連接有還原型谷光甘肽的色譜柱進行親和層析，由于融合蛋白上的GST能夠與還原型谷光甘肽進行結合，所以就可以將目的蛋白從粗蛋白中純化出來。