小鼠精原干細胞分離培養

實驗概要

小鼠精原干細胞分離培養

主要試劑

0.1%明膠、DPBS、0.25%胰蛋白酶、400目細胞篩、精原干細胞培養液、1 mg/mL膠原酶Ⅳ、7 mg/mLDNase、細胞基礎培養液、DMEM-C、精原干細胞凍存液(Kubota et. al., 2004a and 2004b)（4℃條件下可以保存1個月）

主要設備

3.5 cm培養皿、400目細胞篩、12孔板、6孔板、凍存管、15 mL離心管、外科手術刀、外科手術剪、醫用鑷、二氧化碳培養箱、微量移液器、細胞計數儀、超純水系統、超低溫冰箱、實體解剖鏡

實驗材料

2～4只出生5～10天的小鼠。

實驗步驟

（1）分離小鼠睪丸細胞
①向一個3.5 cm培養皿中加入1～2 mL預冷的DPBS。
②脫臼法處死小鼠，用外科手術器械打開腹腔，取出雙側睪丸，置于培養皿中，去除白膜，將睪丸用DPBS洗2～3遍。
③小心去除DPBS，向培養皿中加入1～2 mL 1mg/mL膠原酶Ⅳ，放置于37℃培養箱中孵育10～15 min。取出后用1 mL移液器小心吹打，將睪丸間質細胞吹散。
④將膠原酶Ⅳ小心去除，然后用DPBS輕輕洗兩遍，去除D-PBS，加入0.8 mL0.25%胰蛋白酶和0.2 mL 7mg/mLDNase，37℃培養箱中孵育10 min。取出后用1 mL移液器充分吹打至細胞完全分散。
⑤加入5 mL細胞基礎培養液終止胰蛋白酶反應。
⑥將上一步的細胞懸液用400目細胞篩過濾到離心管。
⑦室溫1500 r/min離心5 min，棄上清，用精原干細胞培養液重懸細胞，并計數。
（2）鋪板和差異貼壁篩選
①用0.1%明膠包被1塊12孔板，放置于室溫或者37℃、5%CO₂培養箱30 min以上。
①將細胞懸液轉移到0.1%明膠包被過的12孔板中，細胞密度為2×10⁵～4×10⁵細胞/孔，每孔1 mL培養液。
②放入37℃、5%CO₂培養箱中培養過夜。
③1 mL移液器反復吹打10～15次后將懸浮的細胞轉移到另一12孔板中(Ryuet. al., 2005)。此時只有很少量的生殖細胞和大部分貼壁生長的體細胞殘留在明膠鋪被的12孔板上，而第二塊板上生殖細胞相對富集(Oatleyet. al., 2006)。
（3）培養及傳代
①隔天半量更換新鮮的精原干細胞培養液。
②一周內，轉移到第二塊12孔板的細胞增殖并鋪滿孔底。第一次傳代的時間取決于克隆生長的狀況，推薦傳代時間為開始培養后10～14天。
③吸盡培養液，用DPBS輕輕洗兩遍，每孔加入200 μl0.25%胰蛋白酶，37℃培養箱內孵育4 min，然后每孔加入1 mL細胞基礎培養液終止胰蛋白酶反應。收集細胞懸液至15 mL離心管，室溫1500 r/min離心5 min。棄上清后用精原干細胞培養液重懸細胞，按照1:1的比例重新鋪板。克隆長到原來的大小大約需要10天，這時候將細胞再傳一代（傳代比例1:2）。
（4）維持生長
①從第三代開始，將細胞接種到絲裂霉素C處理過的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）上。從分離開始30天左右細胞可以穩定傳代。
②細胞穩定后，傳代時細胞密度為3×10⁵細胞/六孔板的一個孔，每三天半量更換新鮮的精原干細胞培養液。
③根據細胞增殖情況，每4～6天傳代。
（5）凍存與復蘇
精原干細胞凍存復蘇的方法與其他細胞相似(Avarbocket. al.,1996)。

1. 凍存
   1.將離心后的細胞用精原干細胞凍存液重懸，密度為16×10⁶～20×10⁶細胞/mL。
   2.1個凍存管分裝1 mL細胞懸液。
   3.用分步法或程序降溫盒凍存細胞，液氮中可長期保存。
   

2. 復蘇
   

1. 提前一天準備鋪有飼養層細胞的培養皿。
   

2. 準備一個15 mL離心管，裝有3 mL DMEM-C備用。
   

3. 將凍存管置于37℃水浴鍋，使細胞懸液迅速融化，然后將細胞懸液加入第①步的離心管中。
   

4. 室溫1500 r/min離心5 min，去除上清，加入精原干細胞培養液重懸后接種到鋪有飼養層細胞的培養皿上。