小鼠角質細胞的分離和培養

實驗步驟                                                         1) 將 1~2 天齡新生裸鼠窒息后，置于培養皿中，用 1% 碘聚乙烯吡咯烷酮液洗凈裸鼠, 流水徹底沖洗，然后用 70% 乙醇洗兩次。

2) 上除小鼠的四肢和尾巴。

3) 將小鼠從尾巴至鼻子的皮膚作一簡單切口，用大鼠牙齒鑷輕輕將整個身體的皮膚剝下，用一把鑷子夾住身體，另一把鑷子拉開皮膚。

4) 將剝下的皮膚組織置于放在冰上的無菌培養皿表面，直至所有的皮膚收集完畢。

5) 用 2 把大鼠牙齒鉗夾住皮膚組織，在含 2.5% 胰蛋內酶的 HBSS 無菌培養皿中漂洗皮膚組織（真皮組織在下），然后置 4℃過夜。表皮不應淹沒在胰蛋白酶液中。

HBSS

NaCl                            8 g/L

KCl                              400 mg/L

KH₂PO₄                     60 mg/L

無水 Na₂ HPO₄        47.86 mg/L

無水葡萄糖               1000 mg/L

NaHCO₃                   350 mg/L

6) 從胰蛋白酶處理液中取出組織，將表皮面朝下置于干燥的無菌細胞培養皿表面。

7) 用剪刀小心地將表皮殘留物剪碎，置于含「常規」培養液（MEM 含 10%FCS,100IU/ml 青霉素，100ug/ml 鏈霉素，2~4 mmol/L L-谷氨酰胺；每 5 只小鼠皮膚用10 ml) 的無菌燒瓶中，磁力攪拌器 37℃劇烈攪拌 45 分鐘。

8) 用 4 層無菌 Nitex 紗布（16xx 孔，Martin 提供）過濾液體。

當其他細胞通過時角質層細胞留在紗布的表面。

9) 用培養液將細胞洗下，培養基的用量約為一塊皮膚 10 ml, 將細胞接種于塑料細胞培養瓶中或玻璃蓋玻片上，37℃ 培養 4~12 小時。

也可將細胞離心后收集沉淀（800 g，10 分鐘），用含 10%DMSO 的培養液再懸細胞，凍存下于液氮中以備用。

10)4~12 小時后觀察培養皿表面的細胞群。

11) 將細胞轉移至低鈣培養液，角質細胞將開始繁殖。