3. BMDC的完全成熟
注：步驟2中獲得的BMDC并非完全成熟的DC,若想得到完成成熟的DC,還需LPS,CD40L或TNF-a等的誘導。
3.1 步驟2.4或2.9中獲得的BMDC以1200rpm離心5 min,棄上清；
3.2 用含重組小鼠GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（10ng/ml）的RPMI完全培養液重懸沉淀，計數后調整細胞濃度為1x106/ml；
3.3 加入24孔培養板中，并加入成熟誘導劑，如TNF-α（250U/ml），LPS（1μg/ml）、或 CD40L（1μg/ml）等；3.437℃，5% CO2培養箱培養2天；
3.5 收集懸浮細胞及疏松貼壁生長的細胞即為成熟樹突狀細胞。
【BMDC大量制備法】-Son法[9]
背景：
1. 該法可在7天內獲得30-40x106個DC/小鼠，是Inaba 經典方法的7-10 倍。DC經14.5%甲泛葡胺（Metrizamide）梯度離心后，純
度（即 CD11c+/I-Ab+ 細胞）可達85-95%.
2. 該法獲得的DC的內吞能力弱于Inaba 經典方法，但分泌的IL-12p70量相似；
3. 該法獲得的DC在混合淋巴細胞反應中比Inaba經典方法呈現更強的刺激能力；
4. 該法獲得的DC能引起更強的特異性T細胞反應；
5. 以上結果提示，該法比經典方法能獲得更多、更成熟的BMDC。
培養步驟：
1. 小鼠骨髓細胞的獲得
見Inaba法（改良）中的相應步驟。
2. BMDC 的大量制備
2.1 步驟1中獲得的小鼠骨髓細胞計數后用含 10% FBS的RPMI 1640完全培養液調整細胞濃度為 2 x 105/ml;
2.2 鋪至6孔培養板內，每孔5 ml 細胞，同時加入重組小鼠GM-CSF（1000 U/ml）和IL-4（1000 U/ml），37℃，5% CO2 培養箱培養；
注：1）作者試探了125 U/ml、250 U/ml、500 U/ml 和 1000U/ml四個細胞因子濃度，發現濃度越低，BMDC細胞產量和成熟度越低，所以仍建議用1000 U/ml。
2） 筆者認為，1000 U/ml 是一個非常高的濃度，會導致培養成本過高。
2.3
在培養的第4天，向培養體系中補充重組小鼠 GM-CSF（1000 U/ml）和 IL-4（1000 U/ml）；
注：向培養體系中直接補充細胞因子而不換液的目的是避免出現任何細胞損失，以獲得最大量的DC.筆者認為，培養過程中必然會出現培養液發黃
的情況，如果不換液而只是添加細胞因子，細胞很快會因為營養不夠而死亡。所以筆者建議在第4天和第7天時將培養液半量或3/4量吸出，離心后加入含足量GM-CSF和IL-4的新鮮培養液重懸細胞沉淀，然后再將
細胞放回至原板。
2.4 培養的第7天收集 DC，用2-4ml RPMI 1640完全培養液重懸，加至等體積的14.5%（w/v）甲泛葡胺上，1200 x g室溫離心20 min。
注：此時的DC為不完全成熟的BMDC,要想進一步成熟，請跳至步驟 3。
2.5 收集中間層，并用RPMI 1640完全培養液洗3次備用。
3. BMDC 的完全成熟
3.1 步驟2.4中收集的 BMDC,重新鋪板，并向培養體系中加入重組小鼠GM-CSF（1000 U/ml）和 IL-4（1000 U/ml），以及 LPS（1-10μg/ml）
3.2 37℃，5% CO2培養箱培養 2 天，獲得成熟的BMDC。
【BMDC大量制備法】-Lutz法[8]
? 背景：
1. Lutz法與Son法相似，均可大量制備BMDC，但與Son 法相比，Lutz法更為廣泛地被采用，從以下兩個方面可以得到印證：
1） 雖然Lutz法比Son法早發表3年（分別是1999年和2002年），但截至2015年12月，PubMed中已有633篇文獻中引用Lutz法，而僅有24篇文獻引用 Son法。
2）
在美國著名的學術社交平臺：www.researchgate.net 上有一個交流帖，問：Does anyone have a protocol
for generating dendritic cells from mouse bone marrow using GM-CSF?
回答者中大多數推薦和盛贊Lutz的BMDC培養法。
2. 該法可獲得更多的 BMDC,達1-3 x 108 個/小鼠，而且純度可達 90-95%；
3. 該法比Son法使用的細胞因子濃度低得多，僅為200 U/ml，而且培養的第8天到 第10天降為30-100 U/ml，這樣可以大幅節約試劑成本；
4.
該法與Inaba經典方法和Son法的最大不同是使用細菌培養皿（Petri
dish）而非細胞培養板來培養骨髓細胞。Inaba的解釋是細菌培養皿不容易使骨髓中的巨噬
細胞貼壁，從而抑制巨噬細胞的發育，進而避免巨噬細胞對DC成熟的抑制作用， 這可能是該法能夠以較低鋪板密度獲得大量 BMDC 的主要原因。
5. 但該法的培養時間較長，需要10-12天，一方面是為了獲得更多的BMDC，另一 方面，大多數粒細胞和淋巴細胞很難存活這么長時間，因此可提高最終獲得的BMDC的純度；
6. 該法僅用GM-CSF進行誘導培養，得到的BMDC中未成熟和成熟DC均有，若 要進一步提高成熟度，需用LPS或TNF-α再誘導1-2 天，其中成熟DC細胞的含量將達到50-70%。