小鼠骨髓的染色體制備

實驗概要

本實驗介紹了制備小鼠骨髓染色體的原理及操作流程。

實驗原理

小鼠骨髓細胞有高度的分裂活性，并且數量非常多，因此不必進行體外培養，可直接觀察到分裂期細胞。處于分裂期的細胞經秋水仙素處理，阻斷紡錘絲的形成，使細胞分裂停止于中期，此時染色體達到最大收縮，具有典型的形態。低滲處理使細胞破裂，便于染色體分散。該方法在臨床上多用于白血病的研究，也可用于觀察毒性物質對機體遺傳物質——染色體損傷的狀況。
小鼠染色體2n=40，均為端著絲粒染色體，雄性為40，XY，雌性為40，XX。

主要試劑

1. 0.85％生理鹽水

2. 固定液(甲醇∶冰醋酸為3∶1)

3. PBS(pH6.8)

4. Giemsa染液

5. 秋水仙素(以100μg/ml的濃度溶于0.85％生理鹽水中)

6. 0.075mol/L KCl

主要設備

1. 顯微鏡

2. 恒溫水浴鍋

3. 低速離心機

4. 電子天平

5. 解剖器械（搪瓷解剖盤、剪刀、鑷子）

6. 注射器

7. 針頭

8. 試管及試管架

9. 滴管及載玻片

實驗材料

小鼠

實驗步驟

1. 秋水仙素處理：取骨髓前3h先給小鼠腹腔注入秋水仙素，注射劑量為100μg／kg動物體重。

2.   取骨髓：用損傷脊髓法處死小鼠，然后用剪刀剪開大腿上的皮膚和肌肉，取出大腿骨，用一小塊紗布搓干凈附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨兩端膨大的關節頭，然后用注射器吸取5ml  0.85％生理鹽水，插入股骨一端，將骨髓細胞沖洗至10ml的離心管中。可重復沖洗多次，直至骨髓腔呈白色為止。

3. 低滲處理：將所獲得的細胞懸浮液以 1000rpm離心10min，吸去上清液，留0.2ml沉淀物，加0.075mol/L KCL 溶液（37℃）至8ml刻度，將細胞沉淀物吹散打勻，在37℃水浴低滲25min。

4.  固定：低滲處理后，立即加入1ml新配制且預冷的固定液，抽打均勻，然后1000  rpm離心10min，棄上清。沿管壁加固定液至6ml，吹散細胞后靜止固定10min，即第一次固定。按上述條件離心，去上清液，再次加入固定液至6ml，進行第二次固定。10min后離心吸去上清液，留0.2ml沉淀物，再往沉淀物中滴加4滴固定液，沖勻制成細胞懸液。

5. 滴片：取事先在冰箱中預冷的載玻片，從約375px高處向每個載玻片上滴1～2滴細胞懸液于粘有冰水的載玻片上，晾干。

6. 染色：取制片平放在玻璃板上，用1∶9 Giemsa染液染色20min，流水沖洗后晾干。

7. 觀察：小白鼠染色體的形態特征，并計算2n的染色體數目。