作用類似于電泳,但是相對于電泳更靈敏,更清晰一些。
通過溶解曲線可以了解目的產物TM值,是否出現雜峰。
一般溶解曲線的結果+電泳的結果和在一起相對比較準確。
當然最后片段也可以測序最終確定目的產物。
主要的是:根據溶解曲線可以確定以下幾點:
a.擴增產物是否單一,即是否含有引物二聚體等其它非目的性產物。
如果在90度左右的時候溶解曲線陡然下降,說明產物較純。
b.可以確定產物的Tm值,一般在90度以上。
可能用途更多,最常用的主要的兩點就是這兩個了。
針對溶解曲線還有一條相應的曲線,看起來更方便一些。
DNA溶解曲線表示擴增產物的特異性。
曲線橫坐標是溫度,每個溫度點一個。
一般從60到98度縱坐標是熒光強度的變化值(不是強度本身)。
一開始加熱的時候,雖然熒光強度比較強,但是由于雙鏈沒有解離,所以熒光強度保持不變。
當加熱接近于PCR產物Tm時,雙鏈開始解離,熒光強度變小,機器會比較前后2個溫度點的熒光強度,然后把2者的差值標在圖上。
Tm到達時,有一般雙鏈解離,這時的熒光強度變化最大(峰值)。
再加熱,雙鏈全部解離,所以熒光強度的變化又變小了。
PCR產物大小不一,但是只要有相同或者相近的Tm,峰值就有可能在一個位置上。
如果實際測得的峰值和理論計算的吻合,問題不大。
如果有差別,說明有非特異性產物,不要再用SYBR GREEN方法。