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  • 發布時間:2022-09-09 14:15 原文鏈接: 小rna反轉溶解曲線出現雜峰結果可靠嗎

    作用類似于電泳,但是相對于電泳更靈敏,更清晰一些。
    通過溶解曲線可以了解目的產物TM值,是否出現雜峰。
    一般溶解曲線的結果+電泳的結果和在一起相對比較準確。
    當然最后片段也可以測序最終確定目的產物。
    主要的是:根據溶解曲線可以確定以下幾點:
    a.擴增產物是否單一,即是否含有引物二聚體等其它非目的性產物。
    如果在90度左右的時候溶解曲線陡然下降,說明產物較純。
    b.可以確定產物的Tm值,一般在90度以上。
    可能用途更多,最常用的主要的兩點就是這兩個了。
    針對溶解曲線還有一條相應的曲線,看起來更方便一些。
    DNA溶解曲線表示擴增產物的特異性。
    曲線橫坐標是溫度,每個溫度點一個。
    一般從60到98度縱坐標是熒光強度的變化值(不是強度本身)。
    一開始加熱的時候,雖然熒光強度比較強,但是由于雙鏈沒有解離,所以熒光強度保持不變。
    當加熱接近于PCR產物Tm時,雙鏈開始解離,熒光強度變小,機器會比較前后2個溫度點的熒光強度,然后把2者的差值標在圖上。
    Tm到達時,有一般雙鏈解離,這時的熒光強度變化最大(峰值)。
    再加熱,雙鏈全部解離,所以熒光強度的變化又變小了。
    PCR產物大小不一,但是只要有相同或者相近的Tm,峰值就有可能在一個位置上。
    如果實際測得的峰值和理論計算的吻合,問題不大。
    如果有差別,說明有非特異性產物,不要再用SYBR GREEN方法。

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