少突膠質細胞來源于1-2 天的大鼠。斷頭后大鼠大腦收集到Ham’s F-12培養液中，移除腦膜和血管。皮質用機械勻漿進行勻漿然后將細胞懸液依次通過230μm和104μm尼龍網進行過濾。細胞通過1000rpm 7分鐘離心進行收集，用添加12.5%胎牛血清的DMEM進行重懸細胞。最后以2.0×105 cells/cm2濃度將細胞接種于培養皿中，將培養皿維持在37°C，5%CO2潮濕環境中。3天后更換培養基，以后每兩天更換一次。9-11天后細胞能夠鋪滿培養皿。少突膠質細胞祖代生長在星形膠質細胞層的上面然后運用旋轉搖床以260rpm 18小時搖蕩分離，通過30μm的尼龍網過濾，然后細胞懸液接種到含無血清培養基的培養皿中。培養基成分：DMEM-Ham‘s F-12混合物（1:1），10mM HEPES，0.1%牛血清蛋白，25μg/mL 人鐵轉蛋白，30nM三碘甲狀腺氨酸，20nM氫化可的松，20nM黃體酮，10nM 維生素H，5μg /mL胰島素，16μg/mL腐胺，30nM硒，50U/mL 青霉素和50μg/mL 鏈霉素，還含有2.5ng/mL 血小板源性生長因子AA和2.5ng/mL 堿性成纖維細胞生長因子用于刺激少突膠質細胞增殖。培養基每兩天更換一次。
如果在沒有血小板源性生長因子AA和堿性成纖維細胞生長因子的存在情況下，原始的少突膠質細胞在無血清培養基中分化成少突細胞，3天后添加3%胎牛血清。原始細胞和成熟的少突膠質細胞都能用于確定神經毒性。