層析法介紹

一、紙層析

紙層析創立于1944年，和薄層層析一樣，紙層析不僅可以用來分離、檢識、測定中藥中復雜的有效成分，而且可以于少量成分的提取精制。它是一種以濾紙上吸附的水為固定相，濾紙作為支持劑的分配層析法。紙層析應用較廣，其主要用途是為分配薄層及分配柱層析摸索條件。雖然紙層析比較費時，易產生拖尾、不耐腐蝕性顯色劑等，但它對水溶性或親水性強的成分分離卻有獨到之處。因而，今天我們對它作以研究。

1．紙層析的分離原理：作為一種分配層析，紙層析是利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數的不同而達到分離目的。紙層析通常多以水為固定相，濾紙為載體。點樣后，先飽和，再浸入適當的展開劑中進行展開。

2．濾紙的選擇：常用層析專用濾紙，純凈無雜質，有一定強度；同時還須質地均勻、平整無折痕，根據樣品及展開劑的要求來選擇下列各型濾紙：

（1）快速濾紙結構巰松，宜用來分離Rf值相差較大的成分。

（2）慢速濾紙結構致密，宜用來分離Rf值相差較小的成分。

（3）中速濾紙比較常用。

濾紙可用二甲基甲酰胺、丙二醇代替水做固定相，以分離親脂性較強的成分；或者選擇不同PH的緩沖液處理，以分離一些酸、堿性成分。

基本選擇依據還是三相關系圖。主要以被分離成分在兩相溶劑中溶解度的不同，以及展開劑的極性來進行統一協調和考慮。

3．展開劑的選擇：

用的展開劑是與水能部分相溶的有機溶劑，如用水飽和的正丁醇、正戊醇、酯等。

有時也向其中加入有機酸、有機堿或一定比例的甲醇、乙醇等。以增大Rf值。

如欲分離極性較大的成分，可在展開劑中加入適量的水、乙醇等。

4．紙層析的理想結果：斑點圓正、集中；被分離成分的Rf值在0.05－0.85之間；分離后各成分間的距離以Rf值計算，最好大于0.05。

5．紙層析的操作步驟：

（1）點樣：將樣品溶解于溶解度大且易揮發的有機溶劑。以毛細管或專業點樣器　吸入樣品溶液進行點樣。注意常規距離：板端留2cm、樣點之間留2cm。
課堂活動：演示講解紙層析的點樣方法。

（2）展開：層析所用容器與TLC基本相同，專用紙譜筒或大試管也被常用。

紙層析的展開方式除了TLC中的所有方式外，還可采用徑向展開。詳見P37。展開結束（溶劑前沿至全紙長3/4處）后，取出濾紙，用鉛筆畫出溶劑前沿位置（防止干燥后溶劑前沿消失）。

（3）顯色：干燥后的濾紙，采用先看（日光下看）、再照（紫外燈下照）、再噴（需要時噴上顯色劑）的步驟進行顯色。注意畫出斑點位置。
Rf值的計算方法與薄層層析相同。

（4）紙層析的應用：

二、柱層析：在柱型容器中進行的層析

一般可用材料有聚丙烯（或其它可用塑料）、有機玻璃、玻璃等做成的柱或柱型、筒形物體；內徑從2cm－10cm不等，柱高等于內徑的10－20倍；下端不能有吸附劑或固定相、載體流出。

柱層析的基本步驟：

1．裝柱：可有濕法裝柱和干法裝柱等兩種方法。裝柱時，干法裝柱與濕法裝柱大同小異：吸附劑均經漏斗進入；干法裝柱與濕法裝柱剛好相反的是，干燥的吸附劑從上端緩緩進入，前者加入空柱底，后者進入了流動相（即課本中的溶劑或者洗脫劑）。

裝柱要領：柱層析的裝柱比較重要，裝柱的效果直接影響層析分離效果。因此，是制備性分離的一種基本操作技能。但是，只要做到密實均勻無氣泡就大功告成。

小技巧：萬一裝柱時帶入氣泡，可從上端壓入大量溶劑將氣泡從下端擠出。

2．加樣:又稱上樣或樣品上柱。多將樣品溶于少量的溶劑（注：柱層析所用的洗脫劑）中，小心的加入層析柱項端的平面內；也可將樣品與易揮發溶劑混合后，再與吸附劑吸收、揮干揮發性溶劑后，撒布于柱的上端；有時也可用多層園形濾紙吸收樣品溶液，再平放到柱的上端。

柱層析加樣的基本要求是均勻薄餅樣層。

3．洗脫：柱層析所用的溶劑，習慣上稱為洗脫劑。洗脫操作的目的當然是要將加入的樣品中各個組分先后從上往下帶出來，并能分開收集各成分。

洗脫的過程中，上端溶劑不能干，分段收集是關鍵；下端燒杯定時換，薄層紙層化學檢；洗脫劑可隨意變，混合過渡為重點。

經驗：每30分鐘－1小時內流出的洗脫劑體積等于所用吸附劑的重量為宜。

分配柱層析的特點：分配柱層析用支持劑裝柱，常用的支持劑有纖維素粉、硅膠、硅藻土。裝柱時先將固定相溶劑（如水或其他溶劑）加入支持劑中，攪拌混勻，再傾入的溶劑中，激烈攪拌，使兩相互相飽和平衡，然后上柱。在層析柱中預先要加入已經用固定相溶劑充分飽和的流動相溶劑。銨一般濕法裝柱，倒入上述處理后的支持劑，注意不斷輕敲管壁，使均勻緊密，然后，放出調出柱面上的流動相。樣品上柱及洗脫過程與吸附柱層析相同。分配柱層析所用的溶劑系統，可用相應的紙層析或分配薄層層析條件進行選擇。