山東大學祁慶生教授基于CRISPRCas9一步式改造細菌基因組

同源重組介導的基因工程，已廣泛應用于原核生物中，并具有較高的效率和準確性。然而，用這種方法來實現更大規模的基因組編輯（具有許多基因或大的DNA片段），還是有限的，因為DNA編輯模板構建的程序相對復雜。11月24日，在《Scientific Reports》發表的一項研究中，山東大學生命科學學院的祁慶生教授帶領的研究小組，描述了一個CRISPR-Cas9輔助的非同源末端連接（CA-NHEJ）策略，用于細菌基因高效而快速的失活――以一種不依賴同源重組的方式，并無需無選擇標記的使用。

祁慶生教授早年畢業于山東大學，2001年在德國明斯特大學微生物系獲博士學位。2001年被聘為德國開姆尼茨工業大學生物工程系課題組負責人。2004年回國任山東大學微生物技術國家重點實驗室教授，博士生導師；山東大學國家糖工程中心研究員。教育部新世紀優秀人才。主要研究方向為：微生物合成與代謝調控。

容易和有效地精確操縱真核生物和原核生物的基因組，在各種應用中――從功能基因組位點的遺傳分析到人為代謝流量再分配，是非常理想的。為此，同源重組（HR）為基礎的基因組工程已被廣泛應用。基于噬菌體的重組蛋白的引入，徹底改變了這個過程，從而實現了高效的遺傳操作，特別是在原核生物中。λ-Red和Rec E／T是兩個著名的重組系統，已被廣泛使用；然而，高效的HR都需要一個供體DNA片段（兩側是同源性序列）作為編輯模板。此外，篩選具有理想表型的遺傳變異，需要選擇性標記的染色體整合（通常是一個抗生素抗性標記），其次是它的最終去除以用于迭代工程。

CRISPRs和CRISPR相關蛋白（Cas）蛋白的新應用，已經徹底改變了基因組工程。在單引導性RNA（sgRNA）的指導下，CRISPR-Cas9系統可在任何基因組位點上產生雙鏈斷裂（DSBs）。這些DSBs可以由HR或通過非同源末端連接（NHEJ）修復。在高等生物中，相比較HR而言，NHEJ是主要的DNA修復系統，來維持基因組的穩定性。NHEJ完全適合于管理DSBs，因為這條路徑沒有顯示出對DNA末端結扎的序列要求。

然而，由于斷裂的DNA末端經常損壞，并需要進行修改，NHEJ修復機制往往容易在結合位點產生插入或缺失（indel）突變。因此，在可編程的CRISPR-Cas9 DNA切割系統的幫助下，NHEJ能產生移碼突變，破壞靶基因，而無需使用同源修復供體。而在原核生物中，這一強大的DNA修復機制并不普遍，由于它們普遍缺乏NHEJ途徑，Cas9產生的DSB對大多數微生物是致命的。最近的研究表明，參與真核生物NHEJ的關鍵因素――Ku70/Ku80二聚體和DNA連接酶IV，在原核生物中存在功能性的同系物。細菌的Ku蛋白在尺寸上比它們的真核生物相對物小得多，但卻通過在斷端形成環形的同型二聚體結構，而保護受損的DNA。

在某些物種中，如結核分枝桿菌和芽孢桿菌，保守的原核NHEJ途徑可保護細菌基因組免于意想不到的DSBs，并促進遺傳變異。該系統也可以被利用來開發一種細菌基因組工程方法，比依賴于HR的基因組工程方法更簡單，其中選擇性標記和供體DNA模板是不必要的。

在這項研究中，研究人員描述了一個CRISPR-Cas9輔助的非同源末端連接（CA-NHEJ）策略，用于細菌基因高效而快速的失活――以一種不依賴同源重組的方式，并無需無選擇標記的使用。該研究表明，CA-NHEJ可以用來一步式地刪除大的染色體DNA片段，而無需同源DNA模板。因此，它是一種新的和功能強大的工具，用于細菌基因組編輯，并具有加速基因組進化的潛力。