差異基因表達研究方法介紹（DDPCR；GENEFISHING；GENECHIP）

差異基因表達的研究受到了廣泛的關注，常用的技術有DD-PCR；GENE-FISHING；GENE CHIP等。簡單介紹如下：

DDRT -PCR技術即mRNA差異顯示聚合酶鏈式反應技術，此技術是以PCR技術和聚丙烯凝膠電泳技術為基礎，結合銀染或放射性自顯影等顯色技術，能快速有效地鑒定并克隆兩個或多個平行材料之間的差異表達基因。DDRT-PCR技術的基本過程如下：
①提取兩組平行材料中的總RNA或mRNA；
② 在逆轉錄酶作用下，以Oligo dT12MN為錨定引物將mRNA反轉錄成cDNA；
③ 以cDNA為模板利用10一mer隨機引物和錨定引物進行PCR擴增；
④ 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴增產物，結合銀染等顯色方法獲得平行材料間的差異cDNA片段，回收并再擴增差異片段；
⑤Northern blotting 檢測差異cDNA片段是否為陽性片段；
⑥克隆cDNA片段并測序；
⑦ 根據測序結果篩選cDNA文庫或使用RACE技術獲得cDNA片段側翼序列，進而獲得其全長cDNA基因。

GeneFishing技術用來檢測不同樣品間的表達差異。該技術著眼于解決目前用來檢測基因表達差異的方法所面臨的問題，如芯片技術和差異顯示技術。該技術的實驗包括以下三個步驟，反轉錄PCR (RT) 和兩步法 PCR (GeneFishing PCR)。
第一步: 用dT-ACP1引物合成cDNAs的第一鏈。dT-ACP1引物的3′端與mRNA的多聚A互補。這樣第一鏈cDNA包含了dT-ACP1引物 5′端的通用序列。
第二步: 把第一步得到的第一鏈cDNA稀釋后和隨機ACP及 dT-ACP2一起加到PCR管。隨機ACP引物的3′端序列能有效的結合到第一鏈cDNA的某一部位。在第一步PCR時，通過控制條件只能使隨機ACP 的3′端特異的結合到第一鏈cDNA的特定位置，而阻止dT-ACP2的3′端退火結合到第一鏈cDNA。通過第一步PCR合成第二鏈cDNA，其3′端包含了dT-ACP1通用序列的互補序列，而其5′端包含了隨機ACP的通用序列。第三步: 來自第二步的PCR管的混合物在更嚴格條件下進行第二步 PCR，這時使dT-ACP2和隨機ACP能各自退火結合到第二步得到雙鏈cDNA的3′ 端和5′端。既然第二鏈cDNA的3′端序列與隨機ACP引物的通用序列互補，而其5′端與dT-ACP2的通用序列互補，這樣保證了只擴增目標產物。該技術特點如下
(1) 無假陽性。 GeneFishing技術鑒別的差異表達基因均可通過Northern Blot分析或RT-PCR證實！現有的DEG檢測方法，例如生物芯片和差異顯示技術的主要瓶頸就是假陽性的存在。無假陽性可以使研究者能快速辨別可信的差異表達基因。
(2) 無需PAGE（聚丙烯酰胺凝膠），瓊脂凝膠法即足夠。退火控制引物(ACP)極大地提高了PCR擴增的特異度和靈敏度，從而產生特異PCR產物。而且，GeneFishing 技術只需要少量的起始物質。PCR產物可以在標準的溴化乙啶染色的瓊脂凝膠中被檢測，因而省去了使用PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）的繁瑣處理步驟。使用GeneFishing 技術在瓊脂凝膠中產生的條帶具有足夠濃度，可以被Northern Blot方法檢測。
(3) 無需昂貴的檢測方法。放射性/熒光檢測方法由于其成本和危險性而不能廣泛應用。昂貴的檢測方法是現今差別表達基因檢測的另一缺點。因此，可以使用標準溴化乙啶染色的瓊脂凝膠來進行檢測是 GeneFishing 技術的一個主要優勢。
(4) 重復性保證。GeneFishing技術的所需反應試劑均由試劑盒提供。這樣防止了由于使用舊的，不匹配的試劑而帶來的變化，確保了可靠的重復性。
(5) 無需特殊技術。GeneFishing 技術是一種以PCR技術為基礎的創新方法，簡單易用。
(6) 快速經濟。GeneFishing技術使得研究者可以在５小時內確認有效的差異表達基因，不必因為假陽性而浪費時間。相比之下，所有其他DEG篩選方法都需要大量的后續工作和時間來鑒別有效的差異表達基因。
(7) 大范圍的PCR產物。每一個 GeneFishing PCR反應產生從150bp至2kb長度范圍的PCR產物，這不僅提高了鑒別差異表達基因的機會，還為預測基因功能提供了更多的有效序列信息。

基因芯片技術的原理類似我們日常所說的計算機芯片，只是在固體基質上的不是集成著各種半導體管，而是成千上萬的基因探針，待分析的樣品通過和芯片中已知序列的DNA片段堿基互補雜交，經過計算機的分析，從而確定待測核酸序列和性質，表現出基因表達量和一些序列本身的特性。該技術主要包括四個環節：芯片微列陣制備，樣品制備，生物分子反應和信號的檢測分析。目前的制備方法主要是采用表面化學的方法或是組合化學的方法來處理固相基質，如玻璃片或硅片。在固體材料中刻出微濾柵、微通道，并加上微泵、微閥來控制流體。然后將探針以預先設計的順序固定在固體基質上。微列陣制備技術主要有兩種基本方法：原位合成法和點樣法。

以上三項技術比較如下：