差異顯示法

差異顯示法

[原理]：

該實驗方法是針對從特定細胞或組織類型的mRNA池來源的樣品用PCR技術對其中許多的cDNA基因一起進行擴增和顯示的實驗方法。該實驗方法倚賴兩套不同類型的合成寡核苷酸引物：一套錨定反義引物與一套隨機正義引物。錨定反義引物是與mRNA的poly(A)尾及3’-非翻譯區的連接處相復性結合。正義引物是一種10-mer的隨機引物，將錨定引物與隨機引物加入反應混合液，用PCR技術進行雙鏈cDNA產物的擴增。通過比較兩種不同細胞類型或在不同生長條件下同種細胞類型來源的擴增cDNA產物的電泳帶譜，能夠用于鑒定其表達基因圖譜的差異。

方法：

[優化DNA濃度：cDNA第一鏈的制備]

1．用幾支0.5 ml離心管，設立實驗反應管系列，建立對照管和實驗管的RNA最佳濃度。用水對RNA樣品進行5倍連續稀釋系列，產生RNA樣品濃度范圍在1μl/ml與100μg/ml之間系列。

2．從錨定3’-寡核苷酸引物庫中選擇一個或更多的引物，設立不同的稀釋RNA模板量的復性反應系列：RNA模板 8.0μl，錨定3’-寡核苷酸引物2.0μl。反應管在65℃水浴上溫育10 min，然后放置在37℃水浴上。

3．加入復性反應試劑：

5×DD-PCR反轉錄緩沖液       4μl

100 mmol/L DDT              2μl

200μmol/L 4種dNTP混合液   2μl

約25單位/μl Rnase抑制劑   0.25μl

200單位/μl反轉錄酶         20μl

H₂O補足至                    20μl

反應管溫育樣品管在37℃反應1 h。

4．將反應管內樣品在94℃加熱10 min，使反轉錄酶失活。

[優化RNA濃度：雙鏈cDNA的擴增與制備]

5．用8只0.5 ml擴增管設立兩個實驗系列。每只管應該包含如下試劑：

10×擴增緩沖液                                2μl

錨定3’-寡核苷酸引物                     2μl

20 mmol/L 4種dNTP混合液（pH 8.0）            1μl

[α-³²P] dNTP或[α-³²S]dNTP（3000 Ci/mmol）     1μl

5單位/μl熱穩定DNA聚合酶                    1單位

H₂O                                            9μl

對于每支反應管加入2μl 5’隨機引物，輕彈管壁使反應液混勻。

6．從含有測試RNA與對照管RNA的反轉錄的兩個系列的8支試管中各取3μl樣品，蓋上試管，輕輕混勻樣品。

7．如果PCR儀沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層加一滴礦物油（約50μl）。放置離心管在PCR儀上。

8．擴增反應有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：

9．擴增反應程序運行結束后，從PCR儀取出反應管，每支反應管各加入5μl 5×測序膠上樣緩沖液。

10．  應用DNA序列分析型的電解質梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳分離這種放射標記擴增物，電泳在穩定電源作用下進行，到二甲苯腈藍電泳至凝膠長度的三分之二處結束。抽干凝膠，將凝膠放置在放射自顯影底片的下部壓片。

11．  檢查對照與試驗RNA的不同濃度來源的擴增反應產物的DNA條帶譜型。一種理想的差異顯示的條帶譜型最好能清晰地分辯100～250條電泳譜帶。DNA模板的最佳量對于不同的樣品、不同的引物也是個不相同的。選擇對照與試驗RNA的最適濃度，使得在該濃度下引物配對引導擴增得到最大量的DNA產物。

[用于差異顯示的擴增cDNA的制備]

12．  應用所有的引物組合與RNA模板最佳量，重新復性，反轉錄和擴增反應。設計在PCR儀上用96孔板即微量滴定板設立所有的反應循環。

13．  應用聚丙烯酰胺測序膠電泳分離擴增反應產物，如步驟9和10。用每對引物所獲得的擴增反應樣品上樣在測序凝膠上的毗鄰的泳道上，比如應用配對引物A+B從一種RNA樣品所獲得的擴增樣品與同一對引物A+B從另一種RNA樣品所獲得的另一個擴增產物在凝膠泳道上相鄰。用這種方法對于樣品編排序號后大大簡化了對于放射自顯影帶譜的比較研究。

14．  從不同的RNA樣品中每一對引物所獲得的擴增產物的帶譜的比較研究。

[差異顯示的cDNA的回收與重擴增]

15．  從抽干的聚丙烯酰胺凝膠上回收目的條帶。防止放射自顯影X線片在凝膠的上方，對于放射自顯影X線片上的目的條帶的位置用軟鉛筆輕劃標記。用干凈剃須刀刀刃沿鉛筆標記將上層的放射自顯影膠片與下層的凝膠一并切割，切下每一條目的的條帶，將目的條帶的凝膠條貼放在Whatman 3MM紙上；將每一薄片的抽干凝膠紙片放入一只0.5 ml的離心管（內有50μl滅菌水）。

16．  用小的針穿刺每一只浸泡過液的0.5ml的離心管的底部；把每一只穿刺管放入一只1.5 ml離心管中，離心20 s后將洗脫液轉移至另一只更大的離心管中，丟棄擴增管中殘余的凝膠條和Whatmen 3MM紙條。

17．  用已洗脫液中的DNA片段作模板，在擴增反應管中一次加入試劑：

10×擴增緩沖液                                2μl

聚丙烯酰胺凝膠中洗脫的DNA樣品                3μl

5’-隨機寡核苷酸引物                             2μl

3’-錨定寡核苷酸引物                            2μl

20 mmol/L 4種dNTP混合液（pH 7.0）             1μl

5單位/μl Taq熱穩定DNA聚合酶                  2單位

H₂O                                             9.5μl

18．  如果PCR儀沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴礦物油（約50μl）。放置離心管在PCR儀上。