差異DNA的PCR擴增實驗

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

dNTP 溶液（包含所有 4 種 dNTP，各 10 mmol/L)

2. 酶和酶緩沖液

PCR 反應緩沖液，10X

聚合酶混合液，50X(Advantage2，Clontech，或相當產品）

3. 核酸和寡核苷酸

DNA 樣品（即方案 2 第 16 步中的各消減樣品）

嵌套 PCR 引物 NP1(10umol/L)

嵌套 PCR 引物 NP2R(10umol/L)

PCR 引物 PI(10umol/L)

來自方案 1 第 4 階段第 8 步的未消減檢測者對照

4. 專用設備

熱循環儀，預設至 72°C

5. 附加試劑

2% 瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑與設備

二、方法

1. 初級 PCR

（1）每個稀釋的 DNA 樣品（即方案 2 第 16 步中的各消減樣品，以及方案 1 第 4 階段第 7步中相應的稀釋但未消減的檢測者對照），各取 1ul分裝到準確標記的離心管中。冷凍的樣品應該解凍，并在 72°C 溫育，然后吹吸混勻再使用。

（2）另取一個離心管，為所有的初級 PCR 管配制一個主體混合液。按照下面的順序將試劑混合。

滅菌水                                     19.5ul

PCR 反應緩沖液，10X            2.5ul

dNTP 溶液（10mmol/L)           0.5ul

PCR 引物 PI(10pmol/L)           1.0ul

50X 聚合酶混合液                   0.5ul

總體積                                     24.0ul

（3）取 24ul 主體混合液，分裝到第 1 步準備的各反應管中。

（4）用 1 滴礦物油覆蓋。

（5）在熱循環儀中，將反應混合液 74°C 溫育 5 min，以延伸接頭。這一步「填充」接頭所缺失的鏈，因而產生了 PCR 引物的結合位點。不要將樣品從熱循環儀中取出。

（6）立即開始下面的循環。

（7）從每個管中取 4ul, 在 2.0% 瓊脂糖 TAE 凝膠上分析。

對于某些復雜的消減（復雜的組織或其核基因鉭），建議分兩步進行初級 PCR, 這樣可以顯著降低背景。首先，進行本方案所描述的初級 PCR, 然后按照方案 4 第 1 階段笫 10 步所描述的步驟再進行一次初級PCR。最后再逬入次級 PCR(方案 3)。

2. 次級 PCR

（8）每個初級 PCR 產物各取 2ul, 用 38ul 水稀釋。

（9）從第 1 步稀釋的各初級 PCR 產物中，各取 lul，加到標記好的離心管中。

（10）按照下面的順序將試劑混合，為次級 PCR 及一個附加反應的樣品配制主體混合液。

滅菌水                                            18.54ul

PCR 反應緩沖液，10X                    2.5ul

嵌套 PCR 引物 NH(10umol/L)         1.0ul

嵌套 PCR 引物 NP2R(10umol/L)     1.0ul

dNTP 溶液（10 mmol/L)                 0.5ul

50X 聚合酶混合液                           0.5ul

總體積                                             24.0ul

（11）將 24ul 主體混合液分裝至第 2 步的各反應管中。

（12）用 1 滴礦物油穎蓋。

（13）立即開始下面的循環。

（14）從每個管中取 4ul，在 2.0% 瓊脂糖 TAE 凝膠上分析。

（15）反應產物應保存在- 20°C。現在，這個 PCR 產物就富集了差異 DNA。

如果不需要 MOS, 就可以直接進入「消減 DNA 的克隆」這一部分。