差示反轉錄PCR[mRNA差異顯示技術

mRNA差異顯示技術是由美國波斯頓Dena-Farber癌癥研究所的Liang Peng博士和Arthur Pardee博士在1992年創立的。它也稱為差示反轉錄PCR（differential display of reverse transcriptional PCR）簡稱DDRT-PCR。mRNA差異顯示技術是將mRNA反轉錄技術與PCR技術二者相互結合發展起來的一種RNA指紋圖譜技術，具有簡便、靈敏、RNA用量少、效率高、可同時檢測兩種或兩種以上經不同處理或處于不同發育階段的樣品，該方法自問世以來已被廣泛用于差異表達基因的克隆鑒定研究中。其基本原理是，幾乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都帶有一個多聚的腺苷酸結構，即通常所說的poly（A）尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA為模板，以oligo（dT）為引物合成出cDNA拷貝。根據mRNA分子3’-末端序列末端結構的分析可以看到，在這段poly（A）序列起點堿基之前的一個堿基，除了為A的情況之外，只能有C、G、T三種可能。根據這種序列結構特征，P. Peng等人設計合成三中不同的下游引物，它由11個或12個連續的脫氧核苷酸加上一個3’-末端錨定脫氧核苷酸組成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，這樣每一種此類人工合成的寡核苷酸引物都將能夠把總mRNA群體的1/3分子反轉錄成mRNA-cDNA雜交分子。于是，采用這三種引物，可以將整個mRNA群體在cDNA水平上分成三個亞群體。然后用一個上游的隨機引物和與反轉錄時相同的oligo（dT）引物對這個cDNA亞群體進行PCR擴增，因為這個上游的引物將隨機結合在cDNA上 ,因此來自不同mRNA的擴增產物的大小是不同的，可以在測序膠上明顯分辨開來，從而篩選出不同樣品間基因差異表達的DNA片段。

隨著mRNA差異顯示技術的廣泛應用，也逐漸顯露出一些不足之處，如所得特異性cDNA片段克隆的假陽性的比例較高，差異條帶分離困難，獲得的差異擴增片段一般在100bp~600bp太短之間，包含大量的非編碼序列，不利于同源性比較分析等。

以下是以紅豆杉為例進行mRNA差異顯示研究的具體操作。

1實驗材料

1.1紅豆杉細胞 未經MJ誘導處理的A<1>和經MJ誘導處理的B<1>紅豆杉細胞。

1.2寡核苷酸引物

（1）3’錨定引物：

①H-T11A（2uM）: 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’ 
      ②H-T11C（2uM）: 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’ 
      ③H-T11G（2uM）: 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’

（2）5’ 隨機引物：

Kit引物：

①H-AP1（2uM）: 5’-AAGCTTGATTGCC-3’ 
      ②H-AP2（2uM）: 5’-AAGCTTCGACTGT-3’ 
      ③H-AP3（2uM）: 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’ 
      ④H-AP4（2uM）: 5’-AAGCTTCTCAACG-3’ 
      ⑤H-AP5（2uM）: 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’ 
      ⑥H-AP6（2uM）: 5’-AAGCTTGCACCAT-3’ 
      ⑦H-AP7（2uM）: 5’-AAGCTTAACGAGG-3’ 
      ⑧H-AP8（2uM）: 5’-AAGCTTTTACCGC-3’

生工引物：

①H-AP1（2uM）: 5’-AAGCTTCATTCCG-3’ 
      ②H-AP2（2uM）: 5’-AAGCTTCCACGTA-3’ 
      ③H-AP3（2uM）: 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’ 
      ④H-AP4（2uM）: 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’ 
      ⑤H-AP5（2uM）: 5’-AAGCTTCGGCATA-3’ 
      ⑥H-AP6（2uM）: 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’ 
      ⑦H-AP7（2uM）: 5’-AAGCTTACGCAAC-3’ 
      ⑧H-AP8（2uM）: 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’

特異引物：

①5ac: 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’ 
      ②ck5: 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’ 
      ③10ac: 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’ 
      ④10acb: 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’ 
      ⑤2ben: 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’ 
      ⑥3ben：5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’ 
      ⑦Phen：5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’

1.3主要試劑

（1）RNA提取

檸檬酸鈉（Sodum citrate），十二烷基肌氨酸鈉（N-lauryl sarcosine），巰基乙醇（β-mercaptoethanol），異硫氰酸胍（guanidine isothiocyanate）， 焦碳酸二乙酯（DEPC），水飽和酚等購自上海生工生物工程有限公司。

（2）逆轉錄及PCR擴增

SuperscriptTMⅡ試劑盒（Cat No:18064-022，Invitrogen公司），GIBCO BRL公司；RNAimage試劑盒，GenHunter公司；Taq DNA聚合酶和dNTPs，100bp DNA ladder（Cat No:MG0911）,

1.4主要儀器

PTC-100基因擴增儀（Techne公司，英國），GeneGenius 凝膠成像系統（SYNGENE公司，美國）。-70℃超低溫冰箱（Thermo Forma，美國）,PCR超凈臺（基因有限公司，美國）,DYY-Ⅲ-5型穩壓穩流電泳儀（北京六一儀器廠）, 5810R低溫冷凍離心機（Eppendorf，德國）,Micro-MB3616型高速離心機（IEC公司，美國）,Vortex GENIE2（基因有限公司，美國）,GeneQuant核酸定量儀（Pharmacia Biotech 公司,英國）。CS101-2A電熱鼓風干燥箱（銀河，中國重慶），DYY-111 12型三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠），DYY-111 20A型DNA序列分析電泳槽（北京六一儀器廠），TY-80A脫色搖床（北京六一儀器廠）。

2 實驗方法

2.1　總RNA的提取與檢測

（1）用品的準備

塑料器皿，如離心管、Tip頭等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小時以上，高壓滅菌并烘干后使用；所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小時以上，高壓滅菌后4℃保存；玻璃器皿經180℃烘烤12小時以上，冷卻備用。

（2）試劑的配置

① CSB緩沖液 
     42mmol/L檸檬酸鈉（Sodum citrate） 
     0.83%（W/V）十二烷基肌氨酸鈉（N-lauryl sarcosine） 
     0.2mmol/L巰基乙醇（β-mercaptoethanol）（使用前加入）

（3）RNA提取

對懸浮培養細胞A<1>、B<1>進行RNA提取，提取步驟如下：

① 50ml離心管中加入10ml變性勻漿液，冰浴5分鐘。 
     ② 取0.5g細胞在液氮中研磨至粉末，轉移至預冷的變性勻漿液中，加200ulβ巰基乙醇，振蕩混勻。 
     ③迅速加入1ml 2mol/L乙酸鈉（PH4.0），充分混合。 
     ④  加入10ml水飽和酚，劇烈振蕩10~15秒，在冰上放置5分鐘。 
     ⑤ 加入2ml氯仿:異戊醇（24:1），劇烈振蕩10~15秒，在冰上放置15分鐘。 
     ⑥ 4℃，12,000g，離心20分鐘。 
     ⑦ 小心移取上層水相，棄去中間相和下層有機相。 
     ⑧ 加入6ml水飽和酚，劇烈振蕩10~15秒，在冰上放置5分鐘。 
     ⑨ 加入6ml氯仿:異戊醇（24:1）, 劇烈振蕩10~15秒，在冰上放置15分鐘。