常用菌種保藏方法（二）

4．沙土保藏法
　　（1）取河沙加入10％稀鹽酸，加熱煮沸30分鐘，以去除其中的有機質。
　　（2）倒去酸水，用自來水沖洗至中性。
　　（3）烘干，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。
　　（4）另取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數次，直至中性。
　　（5）烘干，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。
　　（6）按一份黃土、三份沙的比例（或根據需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）摻合均勻，裝入10×100mm的小試管或安瓿管中，每管裝1g左右，塞上棉塞，進行滅菌，烘干。
　　（7）抽樣進行無菌檢查，每10支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養基中，37℃培養48小時，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌，方可備用。
　　（8）選擇培養成熟的（一般指孢子層生長豐滿的，營養細胞用此法效果不好）優良菌種，以無菌水洗下，制成孢子懸液。
　　（9）于每支沙土管中加入約0．5ml（一般以剛剛使沙土潤濕為宜）孢子懸液，以接種針拌勻。
　　（10）放入真空干燥器內，用真空泵抽干水分，抽干時間越短越好，務使在12小時內抽干。
　　（11）每10支抽取一支，用接種環取出少數沙粒，接種于斜面培養基上，進行培養，觀察生長情況和有無雜菌生長，如出現雜菌或菌落數很少或根本不長，則說明制作的沙土管有問題，尚須進一步抽樣檢查。
　　（12）若經檢查沒有問題，用火焰熔封管口，放冰箱或室內干燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況。
　　（13）需要使用菌種，復活培養時，取沙土少許移入液體培養基內，置溫箱中培養。
　　此法多用于能產生孢子的微生物如霉菌、放線菌，因此在抗生素工業生產中應用最廣，效果亦好，可保存2年左右，但應用于營養細胞效果不佳。
　　5．液氮冷凍保藏法
　　（1）準備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液體的。
　　（2）加保護劑與滅菌保存細菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細胞時，則將空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內預先加入保護劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌15分鐘。
　　（3）接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內切取菌落圓塊，放入含有保護劑的安瓿管內，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。
　　（4）凍結再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結至-30℃。若細胞急劇冷凍，則在細胞內會形成冰的結晶，因而降低存活率。
　　（5）保藏經凍結至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器（圖Ⅶ-14）的小圓筒內，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內。液氮保藏器內的氣相為-150℃，液態氮內為-196℃。
　　（6）恢復培養保藏的菌種需要用時，將安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中進行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內容物移入適宜的培養基上培養。
　　此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點是需要特殊設備。

　　6．冷凍干燥保藏法
　　（1）準備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管（圖Ⅶ-15），大小要求外徑6—7．5mm，長105mm，球部直徑9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘，備用。

　　（2）準備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達數年至十數年，為了在許多年后不出差錯，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養基中用最適溫度培養，使培養出良好的培養物。細菌和酵母的菌齡要求超過對數生長期，若用對數生長期的菌種進行保藏，其存活率反而降低。一般，細菌要求24—48小時的培養物；酵母需培養3天；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養7—10天。
　　（3）制備菌懸液與分裝以細菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0．2ml。
　　（4）冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達到同樣的目的。
　　將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2>）酒精液或干冰丙酮液，溫度可達-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4—5分鐘，即可使懸液結冰。
　　（5）真空干燥為在真空干燥時使樣品保持凍結狀態，需準備冷凍槽，槽內放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。裝置儀器如圖Ⅶ-16，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內。
　　抽氣一般若在30分鐘內能達到93．3Pa（0．7mmHg）真空度時，則干燥物不致熔化，以后再繼續抽氣，幾小時內，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），保持壓力6—8小時即可。
　　（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（圖Ⅶ-17）繼續抽氣，約10分鐘即可達到26．7Pa（0．2mmHg）。于真空狀態下，以煤氣噴燈的細火焰在安瓿管頸中央進行封口。封口以后，保存于冰箱或室溫暗處。
　　此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對一般生活力強的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用，即使對一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長期保存，一般可保存數年至十余年，但設備和操作都比較復雜。