常用血細胞化學染色3

五、中性粒細胞堿性磷酸酶染色

染色原理

中性粒細胞堿性磷酸酶染色的方法有Gomori鈣-鉆法和kaplow偶氮偶聯法，因為鈣-鉆法操作較為繁瑣且所需時間長，偶氮偶聯法的試劑盒操作方便，染色時間短，故目前國內常用偶氮偶聯法，下面介紹該方法的原理。

kaplow偶氮偶聯法成熟中性粒細胞堿性磷酸酶(neutrophilic alkaline phosphatase, NAP)在pH 9.6左右的堿性環境中，能水解基質液中的磷酸荼鈉底物，釋放出荼酚，后者與重氮鹽偶聯，生成不溶性的有色沉淀，定位于細胞質酶活性所在之處。

試劑器材

1.10%甲醛甲醇固定液

甲醛 25mL

甲醇 75mL

混合后置4℃冰箱保存。

2.丙二醇緩沖液

(1)貯備液(0.2mol/L)

2-氨基-2甲基-1,3-丙二醇 10.5g

蒸餾水 加至50O mL

溶解后保存冰箱內。

(2)應用液(0.05mol/L，pH 9.75)

0.2mol/L貯存液 25mL

0.1mol/L鹽酸 5mL

蒸餾水加至 100 rnL

3.基質孵育液(pH9.5~9.6)α-磷酸荼酚鈉20mg溶于0.05mol/L丙二醇緩沖液20mL，再加堅牢紫醬GBC鹽(或重氮堅牢藍)20mg混合后用濾紙過濾，用前臨時配制。

4.1g/L蘇術素復染液取1g蘇木素加到蒸餾水500mL中，加熱煮沸，使蘇木素溶解，再加入蒸餾水500mL、碘酸鈉200mg、硫酸鋁鉀50g，充分混勻，置棕色玻璃瓶中室溫保存，使用前過濾。

操作步驟

1.固定新鮮干燥的涂片用10%甲醛固定液固定30s，蒸餾水輕輕沖洗30~60s，待干。

2.顯示把涂片浸入基質孵育液中，在室溫下溫育10~15min(冬季放孵育箱溫育)。蒸餾水沖洗2min。

3.復染置蘇木素復染液復染5~8min，蒸餾水沖洗1~2min，待干，鏡檢。

注意事頂

1.堅牢藍等重氮鹽的質量好壞是NAP染色成敗的關鍵。

2.基質孵育液必須臨用前新鮮配制。

3.所用的片子要新鮮。固定后，一般在一周內進行染色。做NAP染色時，最好選擇其他患者的片子做陽性對照。

4.NAP染色以陽性率及積分報告結果。
實驗評價

1.本法較鈣-鉆法簡便、快速，色彩鮮艷，結果準確。

2.臨床上NAP染色應用較廣泛，但受主觀因素影響較大，因此參考值變化較大。所以,NAP積分明顯增高或明顯減低者才有臨床意義，同時要排除生理性影響(如年齡、性別、應激狀態、月經周期、妊娠及分娩等)。

六、鐵染色

染色原理

正常人骨髓中的貯存鐵主要存在于骨髓小粒和幼紅細胞中。骨髓中的鐵在酸性環境下與亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位。

試劑器材

1.酸性亞鐵氰化鉀溶液

200g/L亞鐵氰化鉀溶液 5份

濃鹽酸 1份

取200g/L亞鐵氰化鉀溶液置于試管中，緩緩滴加濃鹽酸，邊滴邊搖勻，待煙霧消失后，過濾備用。

2.2g/L核固紅-硫酸鋁溶液，取硫酸鋁2g溶于100mL蒸餾水中，再加入核固紅0.2g。置37℃水浴中1h并隨時振蕩使其溶解，過濾后備用。

操作步驟

1.固定干燥骨髓涂片用甲醇固定10min，待干。

2.顯示玻片上滴滿酸性亞鐵氰化鉀，37℃染色30min蒸餾水沖洗。

3.復染置核固紅液染10~15min。流水沖洗，待干，鏡檢。

注意事頂

1.玻片需經去鐵處理將新玻片用清潔液浸泡24h，取出后反復水洗，浸入95%乙醇中24h，晾干，再浸泡在5%鹽酸中24h，用雙蒸氣反復浸洗玻片，取出烤干后備用。

2.骨髓取材要滿意，做細胞外鐵時一定要有骨髓碎塊或顆粒，取材不佳時，往往影響結果判斷。

3.酸性亞鐵氰化鉀溶液須新鮮配制。

實驗評價

1.鐵染色是檢查骨髓中貯存鐵最簡便有效的方法，此結果可代表全身貯存鐵的情況，是診斷缺鐵的重要指標之一。骨髓內如肯定有可染鐵的存在，則可排除缺鐵性貧血。

2.鐵染色是臨床應用最廣泛的細胞化學染色之一。其細胞內鐵易受外界鐵的污染，使內鐵陽性率增高；而細胞外鐵雖也會受污染，但較易辨認。鐵染色主要用于缺鐵性貧血和環形鐵粒幼紅細胞增多的貧血，而對于臨床不明原因的貧血做鐵染色外，還應做NAP染色和PAS染色。