常見熒光定量PCR檢測方法比較

　　定量PCR：以參照物為標準，對PCR終產物進行分析或對PCR過程進行監測，從而達到評估樣本中靶基因的拷貝數，稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴增的指數期進行的。

　　常見熒光定量PCR方法比較

　　SYBR Green I 檢測模式

　　SYBR Green I 是一種能與雙鏈 DNA 結合發光的熒光染料。其與雙鏈 DNA 結合后， 熒光大大增強。因此， SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數量相關，可以根據熒光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數量。SYBR Green I 的最大吸收波長約為 497nm，發射波長最大約為 520nm。PCR 擴增程序一般為 94℃～55℃～72℃三步法，40 個循環。SYBR Green I 的缺點：由于 SYBR Green I 沒有特異性，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會結合發光，對 PCR 反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產生熒光，通常本底較高，所以在臨床上使用可能會有假陽性發生。

　　SYBR Green I 的優點：SYBR Green I 的優點是因為其缺點產生，由于它能所有的雙鏈DNA相結合，所以對不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性較好，并且價格相對較低。這對科研是很有利的，因此國內外在科研中使用比較普遍。

　　雜交探針模式(Beacon、FRET)

　　分子信標是一種呈發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近。熒光基團被激發后產生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團產生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子信標的莖環結構中，環一般為 15-30 個核苷酸長，并與目標序列互補；莖一般 5-7 個核苷酸長，并相互配對形成莖的結構。熒光基團標記在探針的一端，而淬滅劑則標記在另一端。在復性溫度下，因為模板不存在時形成莖環結構，當加熱變性會互補配對的莖環雙鏈解開，如果有模板存在環序列將與模板配對。與模板配對后，分子信標將成鏈狀而非發夾狀，使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發時，因淬滅作用被解除，發出激發光子。由于是酶切作用的存在，分子信標也是積累熒光。常用的熒光基團：FAM ，Texas Red 。PCR 擴增程序通常是：94～55～72 ℃三步法，40 個循環。

　　FRET 探針又稱雙雜交探針，FRET 探針由兩條相鄰探針組成，在一條探針的 5`端標記 FAM 熒光基團，另一探針的 3`端標記 Red 640 熒光基團。當復性時，探針結合在模板上，FAM 基團和 Red640 基團相鄰，激發 FAM 產生的熒光，作為 Red640 基團的激發光被吸收，使 Red640發出波長為 640 的熒光。當變性時，探針游離，兩基團距離遠，不能產生 640 波長的熒光。由于 FRET 探針是靠近發光，所以檢測信號是實時信號，非累積信號。常用的熒光基團是：LC-Red640，LC-Red705。

　　能用于實時熒光 PCR 定量的方法很多，各有優缺點，應根據實驗的需要和當前的實驗條件選擇適合自己的方法。