常規組織培養法

一、初代消化培養法

1、 準備：取各種已消毒的培養用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2、 布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。

3、 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。

4、 剪切：用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞。

5、 消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。

6、 分離：在消化過程中見消化液發混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（500~1000轉/min）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養液。

7、計數：用計數板計數，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養液調整后，分裝入培養瓶中。對大多數細胞來說，pH要求7.2~7.4范圍，培養液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO₃調整。

8、培養：置于36.5℃溫箱培養，如用CO₂溫箱培養，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。

二、初代組織塊培養法

1、 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復剪切1mm³塊為止。

2、擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養瓶底可擺布20~30塊。

3、 輕輕翻轉培養瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5℃溫箱培養2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸。

4、 培養：從微箱中取出培養瓶，開塞，46度斜持培養瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養液少許，然后緩緩再把培養瓶翻轉過來，讓培養液慢慢覆蓋附于瓶底上的組織小塊。置溫箱中靜止培養。待細胞從組織塊游出數量增多后。再補加培養液。

三、傳代培養法

1、 吸除培養瓶內舊培養液。

2、向瓶內加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。

3、置溫箱中2~5分鐘，當發現細胞質回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。

4、吸除消化液，向瓶內注入Hanks液數毫升，輕輕轉動培養瓶，把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細胞時，動作要輕，以免把已松動的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養液。

5、用吸管吸取營養液輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。

6、計數板計數后，把細胞懸液分成等份分裝入數個培養瓶中，置溫箱中培養。