帽子轉換RACE實驗

寡核苷酸引物 cDNA 文庫 HerculesHot-Start 聚合酶 HerculesHot-Start 聚合酶緩沖液 dNTP 溶液 TE 反轉錄緩沖液 RNasin Superscript II 逆轉錄酶 生物素標記的引物 Ptotal 帽子發現接頭引物 poly(A)+RNA

熱循環儀 鏈霉抗生物素蛋白磁性珠 磁性分離器 水浴或加熱儀

試劑

5'RACE 能否成功依賴于帽子發現接頭序列結合在 cDNA 合成的起始處。這一步依賴于在第一鏈 cDNA 末端附加額外的寡核苷酸（dC)。已有證據顯示，反轉錄緩沖液如果存在Mn²⁺，能大大提高這一步的效率（SchmidtandMueller1999)。

第 1 階段：反轉錄產生 cDNA 模板

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

dNTP 溶液（含 4 種 dNTP, 各 10mmol/L)

TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)，預熱至 50°C

2. 酶和酶緩沖液

反轉錄緩沖液，5X(250 mmol/LTris-HCl、45°C 時 pH8.3,30 mmol/LMgCl₂，10 mmol/LMnCl₂，50 mmol/LDTT，1mg/mlBSA)

RNasin

Superscript II 逆轉錄酶（Invitrogen)

3. 核酸和寡核苷酸

生物素標記的引物 P_total(生物素標記的引物可以從 Invitrogen 訂購）。P_total 引物的序列見圖 25-6。

帽子發現接頭引物（1mmol/L)。該引物的序列見圖 25-6。

poly(A)⁺RNA

4. 特殊設備

鏈霉抗生物素蛋白磁性珠（例如 Promega 的 Streptavidin MagneSphere particles)

磁性分離器（例如 Promega 的 MagneSphere Magnetic Separation Stand)

預設為 42°C、45°C、50°C、70°C、80°C 的水浴或加熱儀



二、方法

1.在一個無菌的離心管中，于冰浴上混合以下轉錄組分。

反轉錄緩沖液，5X                                    4ul

dNTP 溶液（10 mmol/L)                           0.4ul

帽子發現接頭引物（1mml/L)                     1ul

RNasin(40U/ul)                                          0.25ul

2.在另一個管中，在 12ul 水中加入 lug 的 poly(A)+RNA 和 10pmol 的 Ptotal 引物，80°C 溫育 3 min, 迅速在冰上冷卻，在離心機中離心 5s，加入第一步的反轉錄組分。

3.加 1ul(200U) 的 Superscript II 逆轉錄酶，室溫溫育 5 min，42°C 溫育 30 min，45°C溫育 30 min，然后 50°C 保溫 10 min。

4.70°C 溫育 15 min，使逆轉錄酶失活，用鏈霉抗生物素蛋白磁性珠分離第一鏈 cDNA,要按照生產商的說明進行操作，鏈霉抗生物素蛋白磁性珠的用量是所用生物素化的引物的量的 5 倍。用 TE 在 50°C 洗 3 遍，去掉過量的帽子發現接頭（按照生產商的說明）。

5.用 TE 將反應混合物稀釋至 0.5 ml,4°C 保存（這就是 cDNA 文庫）。

第 2 階段：cDNA 的擴增

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

dNTP 溶液（含 4 種 dNTP，各 10 mmol/L)

2. 酶和酶緩沖液

HerculesHot-Start 聚合酶（Stratagene)

HerculesHot-Start 聚合酶緩沖液（10X)

也可以用其他的熱啟動 PCR 系統，例如 Roche 的 Expand High Fidelity 系統。

3. 核酸和寡核苷酸

生物素化的 cDNA 文庫（由第 1 階段得到）

寡核苷酸引物 GSP1 和 Po(用于 3'RACE), 或 RGSP1 和 Uo(用于 5'RACE),Po 和Uo 的序列見圖 25-6

4. 特殊設備

可設程序的熱循環儀

5. 其他

如果需要進行第二輪擴增，在第 5 步和第 6 步需要下列試劑。

引物 GSP2 和 Pi(用于 3'RACE)，或 RGSP2 和 Ui(用于 5'RACE)。Pi 和 Ui 的序列見圖 25-6。

TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)

二、方法

1. 第一輪

(1) 在一個無菌的 0.2 ml 離心管中混合以下組分。

Hercules Hot-Start 聚合酶緩沖液（10X)       5ul

dNTP 溶液（10 mmol/L)                              1.0ul

HerculesHot-Start 聚合酶                             2.5U
 
H₂0                                                              至 50ul
 
(2) 加入 1ul 的 cDNA 文庫（充分重懸磁性珠）和 25pmol 的 GSP1 與 Po 引物（用于 3'RACE)，或 25pmol 的 RGSP1 與 Uo 引物（用于 5'RACE)。

(3) 在熱循環儀上 98°C 加熱 5 min，使第一鏈產物和鏈霉抗生物素蛋白變性，并激活聚合酶。冷卻至合適的溫度退火 2 min,72°C 延伸 40 min。沒有必要在溫育過程中使鏈霉抗生物素蛋白磁性珠保持懸浮狀態，因為生物素不能與變性的鏈霉抗生物素蛋白相互作用。據報道苯乙烯珠更小，在不攪動的情況下能保持懸浮狀態，因此更有優勢（Schrammet al.2000)。

(4) 按下列程序進行 30 個擴增循環。



72°C 延伸時間一定要根據產物的大小和所用聚合酶的擴增速率進行調整。

2. 第二輪（如果需要）

(5) 取第一輪的部分擴增產物，用 TE 以 1:20 稀釋。

(6) 用第一輪的程序，但省略掉 2 min 的退火和 72°C 40 mm 的延伸步驟，用 GSP2 和 P1引物（用于 3'RACE), 或 RGSP2 he U1 引物（用于 5'RACE) 擴增 1ul 上述稀釋材料。