由光源S發出的光線經聚光鏡o。和06投射到孔徑光闌Q：上，照明位于照明物鏡07前面的視場光闌Q。。通過照明物鏡的光線投射到分光鏡丁上，把光束分成兩部分：一部分反射，另一部分透射。
從分光鏡T反射的光線經物鏡O1。射向標準反射鏡P1。，再重新通過物鏡O1，、分光鏡T，射向目鏡O3。；從分光鏡透射的光線，通過補償板T1、物鏡O2射向工件P2表面，反射后重新經過物鏡O2、補償板T1。、分光鏡T，射向目鏡O3。在目鏡焦平面上兩束光相遇，產生干涉，形成條紋。
使用單色光，測量精度可以更精確一些。為此，儀器備有綠色濾光片F，可以移入或移除光路。由于單色光相干性能較好．便于尋找干涉條紋，所以使用儀器時應先將濾光片移入光路中。反射鏡S3。亦可移入光路，以便通過照相鏡頭O4記錄干涉條紋。目鏡O8在分劃板上有一狹縫，即只截取工件表面細長的一部分，然后經直視棱鏡色散形成所謂的等色級條紋，以便對加工粗糙的或者呈粒狀的工件表面產生規則的干涉條紋，便于測定。
如果擋住射向標準反射鏡的一光路，則工件P2表面經物鏡o2成像在B處，即在視場中能看到試樣表面的像。它與工件表面的微觀平面度形成的干涉條紋一一對應。此即為干涉顯微鏡用于試樣微小高度差測量的原理。