干貨！小鼠肝組織dna的提取詳細步驟

　　實驗原理

　　DNA 以核蛋白形式存在于細胞核中。蛋白酶K 或鏈霉蛋白酶 E 均為廣譜蛋白酶，其重要特性是能在 SDS 和 EDTA 存在下保持很高的活性。在勻漿后提取 DNA 的反應體系中， SDS 可破壞細咆膜、核膜，并使組織蛋白與 DNA 分子分離， EDTA 抑制細胞中 DNase 活性，蛋白酶 K 或鏈霉蛋白酶 E 將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使 DNA 分子完整地分離出來。再用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白質，接著用氯仿抽提以除去 DNA 溶液中微量酚的污染。最后用無水乙醇沉淀 DNA 。為獲得高純度 DNA ，操作過程中常加入 RNase 除去 RNA 。獲得高分子量 DNA 的關鍵是防止 DNase 降解 DNA 。故標本必須新鮮，在提取前細胞就保持完整，核、溶酶體等細胞器應沒有明顯破壞，提取 DNA 用的離心管等器皿及試劑應消毒。操作在4 ℃以下進行。

　　試劑及器材

　　1 ．試劑

　　① 蛋白酶 K ：稱取 20mg 蛋白酶 K 溶于 1ml 消毒雙蒸水中，－20 ℃備用。

　　② RNase( 牛胰 ) ：稱取 10mg RNase 溶于 lml 下列混合液中： 10mmol/l Tris-HCl ， pH8.0 ； 1mmol/L EDTANa2 pH8.0 ； 50 %甘油。

　　③ 10 %SDS 溶液：稱取 10g SDS 溶于 100ml 消毒雙蒸水中，于 65 ℃保溫 2 小時，貯存室溫備用。

　　④ 1 × TE 緩沖液 (pH8.0) ： 10mmol/L Tris-HCl pH8.0 ； 1mmol/L EDTANa2 pH8.0 。配制后高壓滅菌， 4 ℃貯存。

　　⑤ 1 × TE 飽和重蒸酚 (pH8.0)

　　⑥ 氯仿/異戊醇 (24:1V/V) 10mol/LNH4AC ，配制后高壓滅菌， 4 ℃貯存

　　⑦ 無水乙醇 (AR)

　　⑧ 70 %乙醇

　　2 ．器材

　　玻璃勻漿器；離心機；電泳儀；電泳槽；紫外透射反射分析儀。

　　實驗操作

　　1 ．組織 DNA 的提取

　　① 取小鼠新鮮肝組織，去除結締組織，用剪刀剪成細小碎塊

　　② 加 10 倍體積 TE 緩沖液，用玻璃勻漿器在冰浴中中速勻漿，并將勻漿液轉入 10ml 離心管以 4000rpm 離心 10 分鐘，棄上清

　　③ 加 10 倍體積 TE 洗一遍，以 4000rpm 離心 10 分鐘，棄上清，加適量 TE 稀釋

　　④ 取 400μl 稀釋液于 1.5ml 的 Eppendorf 管，緩慢加入 10 %SDS 溶液，至終濃度 0.5 % ( 加 20μl) ，搖勻直至溶液變粘稠

　　⑤ 加入 Rnase(200μg/ml) 至終濃度 20ug/ml(42μl) 混勻，置 37 ℃保溫 60 分鐘總體積 (420μl) 。

　　⑥ 加蛋白酶 K(20mg/ml) 至終濃度 100ug/ml混勻 ( 加 21ul) ，于 50 ℃保溫 3 小時，并間歇攪動 ( 總體積 441μl) 。

　　⑦ 將此溶液冷卻至室溫，加等體積飽和酚抽提，以 10000rpm 離心 10 分鐘；取上清加 1/2 體積飽和酚， 1/2 體積氯仿/異戊醇抽提一次，以 10000rpm 離心 10 分鐘；取上清，加等體積氯仿/異戊醇抽提一次，以 10000rpm 離心 10 分鐘

　　⑧ 加 1/10 體積 5MKAc ，加 2 倍體積無水乙醇充分混勻，以 12000rpm 離心 10 分鐘

　　⑨ 加 1ml70 %乙醇洗沉淀，以 12000rpm 離心 10 分鐘， 待酒精揮發盡后加 20ul TE 溶解， 4 ℃儲存

　　2 ．電泳鑒定

　　取 DNA 樣品 2μl 加上樣緩沖液 10μl ( 含溴酚藍指示劑和甘油 ) ，在 0.8 %瓊脂糖凝膠進行水平微型電泳，電壓<5V/cm ，時間 2 小時左右。電泳后取出凝膠，用 0.5μg/ml 的溴化乙錠染色 20 分鐘，用紫外燈觀察分析