干貨：三代測序技術和原理（一）

   摘要：從1977年第一代DNA測序技術（Sanger法）1，發展至今三十多年時間，測序技術已取得了相當大的發展，從第一代到第三代乃至第四代，測序讀長從長到短，再從短到長。雖然就當前形勢看來第二代短讀長測序技術在全球測序市場上仍然占有著絕對的優勢位置，但第三和第四代測序技術也已在這一兩年的時間中快速發展著。測序技術的每一次變革，也都對基因組研究，疾病醫療研究，藥物研發，育種等領域產生巨大的推動作用。在這里我主要對當前的測序技術以及它們的測序原理做一個簡單的小結。

??生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學的研究有著十分重要的意義。以上（圖1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結構以來，整個測序技術的發展歷程。

??第一代測序技術

??第一代DNA測序技術用的是1975年由桑格（Sanger）和考爾森（Coulson）開創的鏈終止法或者是1976-1977年由馬克西姆（Maxam）和吉爾伯特（Gilbert）發明的化學法（鏈降解）. 并在1977年，桑格測定了第一個基因組序列，是噬菌體X174的，全長5375個堿基1。自此，人類獲得了窺探生命遺傳差異本質的能力，并以此為開端步入基因組學時代。研究人員在Sanger法的多年實踐之中不斷對其進行改進。在2001年，完成的首個人類基因組圖譜就是以改進了的Sanger法為其測序基礎，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應，在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列（圖2）。這個網址為sanger測序法制作了一個小短片，形象而生動。

??值得注意的是，就在測序技術起步發展的這一時期中，除了Sanger法之外還出現了一些其他的測序技術，如焦磷酸測序法、鏈接酶法等。其中，焦磷酸測序法是后來Roche公司454技術所使用的測序方法2–4，而連接酶測序法是后來ABI公司SOLID技術使用的測序方法2,4，但他們的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中斷DNA合成反應的dNTP。

??第二代測序技術

??總的說來，第一代測序技術的主要特點是測序讀長可達1000bp，準確性高達99.999%，但其測序成本高，通量低等方面的缺點，嚴重影響了其真正大規模的應用。因而第一代測序技術并不是最理想的測序方法。經過不斷的技術開發和改進，以Roche公司的454技術、illumina公司的Solexa，Hiseq技術和ABI公司的Solid技術為標記的第二代測序技術誕生了。第二代測序技術大大降低了測序成本的同時，還大幅提高了測序速度，并且保持了高準確性，以前完成一個人類基因組的測序需要3年時間，而使用二代測序技術則僅僅需要1周，但在序列讀長方面比起第一代測序技術則要短很多。表1和圖3對第一代和第二代測序技術各自的特點以及測序成本作了一個簡單的比較5，以下我將對這三種主要的第二代測序技術的主要原理和特點作一個簡單的介紹。

1. Illumine

??Illumina公司的Solexa和Hiseq應該說是目前全球使用量最大的第二代測序機器，這兩個系列的技術核心原理是相同的2,4。這兩個系列的機器采用的都是邊合成邊測序的方法，它的測序過程主要分為以下4步，如圖4.

??（1）DNA待測文庫構建

??利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段，目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打斷成200-500bp長的序列片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構建出單鏈DNA文庫。

??（2）Flowcell

??Flowcell是用于吸附流動DNA片段的槽道，當文庫建好后，這些文庫中的DNA在通過flowcell的時候會隨機附著在flowcell表面的channel上。每個Flowcell有8個channel，每個channel的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對（這就是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面進行橋式PCR的擴增。

??（3）橋式PCR擴增與變性

??橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進行橋形擴增，如圖4.a所示。經過不斷的擴增和變性循環，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束，每一個束都含有單個DNA模板的很多分拷貝，進行這一過程的目的在于實現將堿基的信號強度放大，以達到測序所需的信號要求。

??（4）測序

??測序方法采用邊合成邊測序的方法。向反應體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標記的4中dNTP（如同Sanger測序法）。這些dNTP的3’-OH被化學方法所保護，因而每次只能添加一個dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉。接著，再加入激發熒光所需的緩沖液，用激光激發熒光信號，并有光學設備完成熒光信號的記錄，最后利用計算機分析將光學信號轉化為測序堿基。這樣熒光信號記錄完成后，再加入化學試劑淬滅熒光信號并去除dNTP 3’-OH保護基團，以便能進行下一輪的測序反應。Illumina的這種測序技術每次只添加一個dNTP的特點能夠很好的地解決同聚物長度的準確測量問題，它的主要測序錯誤來源是堿基的替換，目前它的測序錯誤率在1%-1.5%之間，測序周期以人類基因組重測序為例，30x測序深度大約為1周。

1. Roche 454

??Roche 454測序系統是第一個商業化運營二代測序技術的平臺。它的主要測序原理是（圖5 abc）2：

??（1）DNA文庫制備

??454測序系統的文件構建方式和illumina的不同，它是利用噴霧法將待測DNA打斷成300-800bp長的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或將待測DNA變性后用雜交引物進行PCR擴增，連接載體，構建單鏈DNA文庫（圖5a）。

??（2）Emulsion PCR （乳液PCR，其實是一個注水到油的獨特過程）

??454當然DNA擴增過程也和illumina的截然不同，它將這些單鏈DNA結合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。

??乳液PCR最大的特點是可以形成數目龐大的獨立反應空間以進行DNA擴增。其關鍵技術是“注水到油”（水包油），基本過程是在PCR反應前，將包含PCR所有反應成分的水溶液注入到高速旋轉的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數個被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構成了獨立的PCR反應空間。理想狀態下，每個小水滴只含一個DNA模板和一個磁珠。

??這些被小水滴包被的磁珠表面含有與接頭互補的DNA序列，因此這些單鏈DNA序列能夠特異地結合在磁珠上。同時孵育體系中含有PCR反應試劑，所以保證了每個與磁珠結合的小片段都能獨立進行PCR擴增，并且擴增產物仍可以結合到磁珠上。當反應完成后，可以破壞孵育體系并將帶有DNA的磁珠富集下來。進過擴增，每個小片段都將被擴增約100萬倍，從而達到下一步測序所要求的DNA量。

??（3）焦磷酸測序

??測序前需要先用一種聚合酶和單鏈結合蛋白處理帶有DNA的磁珠，接著將磁珠放在一種PTP平板上。這種平板上特制有許多直徑約為44um的小孔，每個小孔僅能容納一個磁珠，通過這種方法來固定每個磁珠的位置，以便檢測接下來的測序反應過程。

??測序方法采用焦磷酸測序法，將一種比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中，啟動測序反應。測序反應以磁珠上大量擴增出的單鏈DNA為模板，每次反應加入一種dNTP進行合成反應。如果dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團。釋放的焦磷酸基團會與反應體系中的ATP硫酸化學酶反應生成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測序反應中的熒光素分子并發出熒光，同時由PTP板另一側的CCD照相機記錄，最后通過計算機進行光信號處理而獲得最終的測序結果。由于每一種dNTP在反應中產生的熒光顏色不同，因此可以根據熒光的顏色來判斷被測分子的序列。反應結束后，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP，從而導致熒光淬滅，以便使測序反應進入下一個循環。由于454測序技術中，每個測序反應都在PTP板上獨立的小孔中進行，因而能大大降低相互間的干擾和測序偏差。454技術最大的優勢在于其能獲得較長的測序讀長，當前454技術的平均讀長可達400bp，并且454技術和illumina的Solexa和Hiseq技術不同，它最主要的一個缺點是無法準確測量同聚物的長度，如當序列中存在類似于PolyA的情況時，測序反應會一次加入多個T，而所加入的T的個數只能通過熒光強度推測獲得，這就有可能導致結果不準確。也正是由于這一原因，454技術會在測序過程中引入插入和缺失的測序錯誤。

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