平板劃線分離法包括連續劃線和分區劃線。
平板劃線分離法：在被檢標本中，常混雜有多種細菌，平板劃線分離法可使這多種細菌在培養基表面分散生長，各自形成菌落，以便根據菌落的形態及特征，挑選單個菌落進行純培養。
常用的平板劃線分離法有以下兩種：
（1）連續劃線分離法：此法主要用于雜菌不多的標本。用接種環取標本少許，于平板1/5處密集涂布，然后來回作曲線連續劃線接種，線與線間有一定距離，劃滿平板為止。
（2）分區劃線分離法：本法適用于雜菌量較多的標本。先將標本均勻涂布于平板表面邊緣一小區（第一區）內，約占平板1/5面積，再在二、三、……區依次連續劃線。每劃完一個區，均將接種環滅菌一次。每一區的劃線均接觸上一區的接種線2～3次，使菌量逐漸減少，以獲得單個菌落。