年終盤點：2018年基因編輯盤點

　　2018年11月，中國科學家賀建奎聲稱世界上首批經過基因編輯的嬰兒-一對雙胞胎女性嬰兒---出生。他利用一種強大的基因編輯工具CRISPR-Cas9對這對雙胞胎的一個基因進行修改，使得她們出生后就能夠天然地抵抗HIV感染。這也是世界首例免疫艾滋病基因編輯嬰兒。這條消息瞬間在國內外網站上迅速發酵，引發千層浪，有部分科學家支持賀建奎的研究，但是更多的是質疑，甚至是譴責。那么到底什么是基因編輯呢？基因編輯技術指能夠讓人類對目標基因進行“編輯”，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。

　　基因編輯技術中，以鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases, ZFN）和TALEN （transcription activator-like effector nucleases）為代表的序列特異性核酸酶技術以其能夠高效率地進行定點基因組編輯，在基因研究、基因治療和遺傳改良等方面展示出了巨大的潛力。

　　CRISPR/Cas9是繼ZFN和TALEN之后出現的第三代“基因組定點編輯技術”。與前兩代技術相比，其成本低、制作簡便、快捷高效的優點，讓它迅速風靡于世界各地的實驗室，成為科研、醫療等領域的有效工具，而且經過不斷改進后，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

　　基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜志列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短回文重復序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas9是由一種原始的細菌免疫系統改編而成的，它的作用方式是首先在基因組的一個靶位點上切割雙鏈DNA。

CRISPR/Cas9基因組編輯系統，圖片來自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。

　　在CRISPR/Cas9系統中，酶Cas9在DNA靶位點上進行切割，其中這種靶位點是這樣確定的：一種被稱作CRISPR RNA（crRNA）的RNA分子利用它的一部分序列與另一種被稱作tracrRNA的RNA分子通過堿基配對結合在一起，形成嵌合RNA（tracrRNA/crRNA），然后，借助crRNA的另一部分序列與靶DNA位點進行堿基配對，以這種方式，這種嵌合RNA就能夠引導Cas9結合到這個靶位點上并進行切割。在實際應用時，人們可以將tracrRNA和crRNA作為兩種向導RNA（gRNA）或者融合在一起形成單向導RNA（single guide RNA, sgRNA），并被用來引導酶Cas9結合到靶DNA序列上并進行切割，其中Cas9與sgRNA一起被稱作Cas9-sgRNA系統。

　　此外，CRISPR/Cas9系統靶向識別和切割與前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif, PAM）相鄰的特定DNA位點。作為一種最為頻繁用于基因組編輯的Cas9酶，來自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（SpCas9）僅識別作為PAM的NGG序列（簡稱NGG PAM，其中N代表任何一種堿基），這就限制了基因組中能夠被靶向的區域。

CRISPR/Cas9作用機制. 圖片來自Frontiers in Genetics, 24 September 2015, doi:10.3389/fgene.2015.00300。

　　與CRISPR/Cas9相比，堿基編輯并不切割DNA雙螺旋，而是在組成DNA或RNA的四個堿基中，利用酶精確地重新排列其中的一個堿基上的一些原子，從而將這個堿基轉化為一個不同的堿基，同時不改變其周圍的堿基。這種能力大大增加了改變遺傳物質的選擇手段。2017年，通過堿基編輯器編輯單個堿基的技術入選2017年《科學》雜志“科學十大突破”。

　　在2018年，科學家們在基因編輯取得重大的進展，讓我們一起看看這個領域在這一年里取得的重大發現。

　　2018年12月，鑒于9p21.3單倍型是目前世界上已知最具影響力的心血管疾病遺傳原因，Valentina Lo Sardo等人收集了來自攜帶著9p21.3單倍型高風險版本或低風險版本的人的血液，并讓血液中的細胞經過重編程后產生誘導性多能干細胞（iPS細胞），隨后利用稱為轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALEN）的分子剪刀對產生的iPS細胞進行基因修飾，從而移除供者細胞基因組中的9p21.3單倍型高風險或低風險版本[1]。接下來，他們誘導這些經過基因編輯的ips細胞變成血管平滑肌細胞。結果表明利用TALEN剔除9p21.3單倍型高風險版本會拯救血管平滑肌細胞的增殖、粘附和收縮。

圖片來自Cell, doi:10.1016/j.cell.2018.11.014。

　　2018年11月，Felicity Allen等人在一項迄今為止最大規模的探究CRISPR作用機制的研究中，發現對經過CRISPR-Cas9切割的DNA的修復依賴于靶DNA和gRNA的精確序列，并且發現在相同的序列中，細胞的這種修復機制是可重復的[2]。他們隨后利用大量的序列數據開發出一種稱為FORECasT的機器學習計算工具，該工具能夠僅使用靶DNA序列來預測修復后的DNA序列。與此同時，HMax W. Shen等人觀察細胞如何修復小鼠和人類基因組中CRISPR靶向切割的2000個位點，并將所獲得的數據輸入到一種稱為inDelphi的機器學習模型中，從而促進這種算法學習細胞如何對每個位點上的切割作出反應，它的預測結果表明在很多位點上，經過校正的基因并不包含大量的變異，而是一種單一的結果，如校正致病性的基因[3]。

　　2018年11月，Haibao Zhu等人將磁性納米顆粒（MNP）與重組的圓柱形桿狀病毒載體（baculovirus vector, BV）相結合，開發出運送CRISPR/Cas9的MNP-BV載體，選擇桿狀病毒載體是因為是它具有較大的裝載能力，而且在局部磁場的作用下能夠克服補體系統導致的桿狀病毒載體局部失活[4]。施加局部的磁場能夠高效地靶向運送MNP-BV載體，并促進將MNP-BV載體轉導到細胞中，從而實現通過空間控制對特定組織或器官中的基因進行修飾。

圖片來自Nature Biomedical Engineering, doi:10.1038/s41551-018-0318-7。

　　2018年10月，Lucas B. Harrington等人發現了迄今為止最小的CRISPR基因編輯系統：在從科羅拉多州來復鎮（Rifle）的一個有毒的凈化場所獲得的地下水樣品中經過測序的古細菌基因組中發現了Cas14蛋白[5]。與Cas9一樣，Cas14具有作為生物技術工具的潛力。由于具有較小的體積，Cas14可能用于編輯小細胞或某些病毒中的基因。不過鑒于Cas14的單鏈DNA切割活性，它更有可能改善目前正在開發的用于快速診斷傳染病、基因突變和癌癥的CRISPR診斷系統。

　　2018年10月，Florian Schmidt等人利用腸道細菌大腸桿菌開展研究，將來自一種不同的細菌物種的編碼CRISPR-Cas9系統的基因導入到大腸桿菌中，其中的Cas9基因與一種逆轉錄酶融合在一起[6]。導入這些編碼CRISPR-Cas9的外源基因的大腸桿菌細胞能夠產生一種結合短mRNA分子的蛋白復合物。這種逆轉錄酶將mRNA翻譯為含有與初始的mRNA相同的遺傳信息的DNA，然后將它們作為間隔序列存儲在CRISPR陣列中。這種過程能夠多次發生，從而使得新的間隔序列以相反的時間順序添加到CRISPR陣列，因此最近獲得的DNA片段總是位于最前面，由此，就開發出開發出一種存儲轉錄事件的細胞記錄設備。在此之前，Weixin Tang等人利用CRISPR構建出一種稱為CAMERA（CRISPR-mediated analog multi-event recording apparatus）的細胞事件記錄技術[7]。

圖片來自Nature, doi:10.1038/s41586-018-0569-1。

　　2018年9月，鑒于在臨床中使用CRISPR/Cas9基因編輯的一個障礙是Cas9核酸酶可能會在錯誤的位點上切割DNA，Pinar Akcakaya等人開發出一種讓脫靶效應最小化的方法：將基因組DNA切割為大約長300個堿基對的片段，給這些片段連接上一系列讓DNA環化的接頭（adapter），隨后引入Cas9和gRNA的復合物，這種復合物在某些位點上切割環狀DNA，從而讓它線性化[8]。另一批核酸酶會降解剩余的未被切割的環狀DNA。通過這種方式，這些研究人員能夠對線性化的DNA進行測序，從而能夠觀察Cas9切割（不論是有意的還是無意的）的位點并預測gRNA是否會導致體內脫靶效應。隨后，他們在小鼠中測試了他們的預測結果：當使用在體外發現的會在基因組中數千個錯誤位點進行切割的gRNA時，在檢測的一部分的預測位點中，超過40％的位點也在小鼠肝臟中發生突變。一個位點在體外篩選中出現的頻率越高，它在體內發生突變的可能性就越大。換句話說，在體外發生差錯的gRNA在體內也會發生差錯。

　　2018年9月，美國邁阿密大學的Carlos Moraes團隊將含有靶向線粒體的TALEN（mitochondrial-targeted TALEN, MitoTALEN）的腺相關病毒（AAV）注射到攜帶著mtDNA突變的小鼠肌肉中，在六個月后，小鼠肌肉組織中的突變mtDNA的水平下降了50％以上---低于通常與線粒體疾病的癥狀相關的水平[9]。與此同時，英國劍橋大學的Michal Minczuk團隊，研究人員將含有靶向線粒體的ZFN（mitochondrially targeted zinc-finger nuclease, mtZFN）的AAV病毒注射到小鼠的尾靜脈中，從而被系統性地運送到心臟中。僅兩個多月后，突變mtDNA的水平在心臟組織中下降了大約40％[10]。

圖片來自Nature Medicine, doi:10.1038/s41591-018-0166-8。

　　2018年9月，Hiroshi Nishimasu等人構建出一種合理設計的SpCas9變異體（SpCas9-NG），它能夠識別作為PAM的NG而不是NGG[11]。這種SpCas9-NG變異體增加了基因組中的靶向范圍，但是具有與野生型SpCas9類似的特異性：在人細胞中，這種SpCas9-NG變異體在攜帶著NG PAM的內源性靶位點中誘導堿基插入或刪除（insertion or deletion, indel）；將這種SpCas9-NG變異體與活化誘導的胞苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）融合在一起能夠調節人細胞中攜帶著NG PAM的靶位點上的C→T轉化，即由堿基胞嘧啶（C）轉化為堿基胸腺嘧啶（T）。

　　2018年9月，Avery C. Rossidis等人將名為BH3的堿基編輯器和CRISPR系統一起導入患有遺傳性酪氨酸血癥1型（HT1）的小鼠胚胎中，結果表明，接受BH3治療的小鼠胚胎，在出生后的3個月里肝臟中經過編輯的肝細胞數量穩定[12]。在HT1小鼠模型中，BH3治療提高了它們的肝臟功能和生存率。與此同時，Lukas Villiger等人將CRISPR/Cas9系統和胞苷脫氨酶結合在一起，將導致苯丙酮尿癥的DNA堿基對C-G轉變為在正常人中出現的T-A，而且接受這種堿基編輯治療的小鼠肝臟中60%的致病基因突變能夠被成功校正，從而使得小鼠體內的苯丙氨酸水平降低到正常水準，而且不再顯示出任何苯丙酮尿癥的癥狀[13]。

CRISPR/Cas9系統和堿基編輯器作用機制示意圖，圖片來自Science期刊。

　　2018年9月，鑒于III型CRISPR/Cas效應復合物在結合到靶RNA時會合成由4或6個腺苷一磷酸（AMP）分子連接在一起而形成的環寡腺苷酸，所產生的環寡腺苷酸誘導細胞進入抗病毒狀態，但是如果長時間處于激活狀態的話，細胞也會死亡，Januka S. Athukoralage等人鑒定出一種稱為環狀核酸酶（ring nuclease）的關閉開關，它特異性地切割這些環寡腺苷酸分子，并且當入侵的病毒遭受破壞時，它讓細胞恢復到未受感染的狀態[14]。環狀核酸酶是CRISPR基因組工程工具包中的一個重要的新組分。這將引發遺傳病和感染治療變革。

　　2018年9月，Kyle E. Watters等人利用一種全面的生物學信息學和實驗篩選方法鑒定出三種阻斷或減少在人細胞中進行CRISPR/Cas12a介導的基因組編輯的抑制劑[15]。與此同時，Nicole D. Marino等人發現了12個Acr基因，這些基因編碼的Acr蛋白包括抑制V-A型CRISPR/Cas系統和I-C型CRISPR/Cas系統的蛋白，如AcrVA1。值得注意的是，當在人細胞中進行測試時，AcrVA1最為有效地抑制Cas12a的一系列直向同源物，包括MbCas12a、Mb3Cas12a、AsCas12a和LbCas12a[16]。這些CRISPR/Cas12a抑制劑提供了對CRISPR基因編輯進行控制的生物技術工具。

通過生物信息手段發現抑制CRISPR/Cas12a的Acr蛋白。圖片來自Science, doi:10.1126/science.aau5138。

　　2018年8月，我國科學家Weiqi Zhang等人在全球首次實現了SIRT6在非人靈長類動物中的全身敲除，獲得了世界上首例特定長壽基因敲除的食蟹猴模型[17]。與SIRT6敲除小鼠表現的加速衰老表型明顯不同，SIRT6敲除的食蟹猴在出生數小時內即死亡。多項分析結果顯示，SIRT6敲除的食蟹猴未見加速衰老表型，卻表現出嚴重的全身發育遲緩。新生SIRT6敲除猴的腦及多種其他器官組織均表現出明顯的胚胎期未成熟的細胞和分子特征。在此之前，我國科學家Sen Yan等人利用CRISPR/Cas9基因編輯技術將人體中導致亨廷頓舞蹈病（Huntington's disease, HD）的具有非常長的谷氨酰胺重復序列的mHTT編碼基因的一個片段導入到豬成纖維細胞中[18]。隨后，體細胞核移植產生攜帶這種基因改變的豬胚胎，由此構建出基因敲入HD豬模型。

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得SIRT6全身敲除的食蟹猴，圖片來自Nature, doi: 10.1038/s41586-018-0437-z.

　　2018年7月，Alex Marson團隊開發出一種強大的分子“剪切和粘貼”系統，用于重寫人T細胞中的基因組序列：當某些數量的T細胞、DNA和CRISPR“剪刀”混合在一起然后暴露在一種適當的電場中時，這些T細胞將攝入DNA和CRISPR剪刀，并且精確地將特定的基因序列整合到CRISPR在基因組中的靶切割位點上[19]。它在未來有助于加速開發出新的更加安全的治療癌癥、自身免疫疾病和其他疾病（包括罕見的遺傳性疾病）的療法。

　　2018年7月，Michael Kosicki等人發現CRISPR/Cas9基因編輯工具能夠導致基因組上的靶位點附近發生大片段DNA缺失和重排。這些重排導致之前相隔遙遠的DNA序列被拼接在一起。這種現象在他們測試的所有三種細胞類型---小鼠胚胎干細胞、小鼠造血祖細胞和一種人分化細胞系---中都很普遍[20]。這些變化能夠干擾對實驗結果的解釋，并且可能使得設計基于CRISPR的療法的努力復雜化。

針對人胚胎干細胞的基因編輯實驗揭示出CRISPR-Cas9系統的不精確性。圖片來自Annie Cavanagh via Wellcome/CC BY NC。

　　2018年7月，Lili Wang等人對歸巢核酸內切酶（meganuclease）進行基因形式，使得它能夠特異性地識別并且失活PCSK9基因，隨后利用腺病毒載體（AAV）攜帶經過基因修飾的歸巢核酸內切酶來干擾靈長類動物肝臟中的PCSK9基因，結果發現在利用中等和高劑量AAV載體治療的動物機體中，PCSK9的水平下降了45%-84%，而且有害膽固醇的水平也下降了30%-60%[21]。

　　2018年7月，Demosthenes P. Morales等人開發出光觸發的基因組編輯方法，這種方法的關鍵是空心的金納米球，在這些金納米球上包被著DNA報告鏈（發出紅色熒光）和由Cre重組酶與細胞穿透肽組成的融合蛋白[22]。一旦被攝入到細胞中，這些金納米球被包埋在內體（endosome）中。超快脈沖近紅外激光 ---對細胞無害且高效地穿過組織---隨后照射這些被包埋的金納米球和它們的蛋白涂層。這種照射導致這些金納米球受到激發，這會導致納米氣泡形成，從而讓內體出現開口并允許它的蛋白內含物逃出。這些蛋白如今自由地前往存儲著遺傳物質的細胞核中，并讓細胞穿透肽進入。Cre能夠尋找、剪切細胞中的雙螺旋DNA，并且將DNA報告鏈粘貼到雙螺旋DNA中。

圖片來自Small, doi:10.1002/smll.201800543。

　　2018年6月，Emma Haapaniemi等人發現在實驗室環境中對人類細胞進行CRISPR-Cas9基因編輯操作或許會激活名為p53的癌癥抑制蛋白，一旦被激活后，p53就會降低CRISPR-Cas9基因編輯的效率，而不攜帶p53或無法激活p53表達的細胞就會表現出較好的基因編輯效果，但不幸的是，缺少p53常備認為會使得細胞失控生長并且發生癌變[23]。通過挑選已經成功修復損傷基因的細胞，這可能就會在無意中選擇不攜帶功能性p53的細胞，如果將這種細胞轉移到患者體內，以此作為基因療法來治療遺傳性疾病，這樣的細胞或許就會誘發癌癥。

　　2018年5月，Matthew G. Costales等人開發出一種經設計后能夠精確和有選擇性地結合特定RNA的稱為RIBOTAC（ribonuclease-targeting chimeras）的技術，這種RIBOTAC復合物的第一部分是RNA降解酶RNase L，它的另一個部分是藥物類似分子Targaprimir-96，用于與一種已知促進癌細胞增殖的microRNA致癌基因（即miRNA-96）結合[24]。這種RIBOTAC復合物局部激活內源性的RNase L，從而切割癌細胞中的miRNA-96前體，這又會增加促凋亡轉錄因子FOXO1表達，從而選擇性地觸發惡性腫瘤細胞死亡。

圖片來自Journal of the American Chemical Society, doi:10.1021/jacs.8b01233。

　　2018年4月，Cameron Myhrvold等人開發出一種更加簡單的方法，從而允許Cas13直接在唾液或血液等體液樣品中檢測它的靶標。這種方法被稱作HUDSON（Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases），通過對臨床樣品進行快速的化學和熱處理來滅活某些會降解基因靶標的酶。這些經過處理的臨床樣品隨后通過SHERLOCK診斷平臺進行檢測，最終的檢測結果（陽性或陰性）能夠在試紙條上很容易地觀察到[25]。Feng Zhang團隊對SHERLOCK診斷平臺進行一系列優化，讓這種平臺使用來自不同細菌種類的Cas13和Cas12a（以前稱為Cpf1）酶來產生額外的信號；此外，還添加了一種額外的CRISPR相關酶（即Csm6）來放大檢測信號，從而增加了SHERLOCK的靈敏度，并增加準確地定量確定樣品中的靶分子水平和一次測試多種靶分子的能力[26]。Jennifer A. Doudna團隊觀察到Cas12a鎖定它的靶標并進行切割，它就會開始撕碎它能夠發現的所有單鏈DNA，開發出一種簡單的被稱作DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）的新方法，它能夠實現靈敏而又準確的DNA檢測[27]。這種SHERLOCK診斷平臺是Feng Zhang團隊在一年之前基于Cas13酶和RNA報告分子開發出來的：在經過兩個擴增步驟后，當Cas13a檢測到靶RNA序列時，它的無區分的RNA酶活性（即附帶切割活性）也會切割這種RNA報告分子，從而釋放可檢測到的熒光信號[28]。

圖片來自Zhang lab, Broad Institute。

　　2018年3月，Silvana Konermann等人構建出一種靶向RNA而不是靶向DNA的新工具，并利用它校正來自一名癡呆癥患者的細胞中的蛋白不平衡，從而讓它們恢復到健康水平。這種被稱作CasRx的新工具來自黃化瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）XPD3002，它為科學家們提供一種強大的方法來開發新的基因療法和研究基礎的生物學功能[29]。

　　2018年2月，鑒于spCas9對靶DNA序列的識別依賴于特定的PAM序列---NGG序列，僅1/16的人類基因組區域含有這種PAM序列，這無疑限制了基因編輯的范圍，為此，Johnny H. Hu等人開發出稱為xCas9的SpCas9變體，該變體廣泛識別多種PAM序列，包括NG、GAA和GAT，編輯范圍至少增加了4倍，可以靶向編輯基因組的1/4區域[30]。更重要的是，相比于spCas9，xCas9錯誤編輯的概率降低了。

在gRNA（綠色和紅色）的幫助下，CRISPR/Cas9通過結合到PAM序列（黃色）上切割靶DNA序列，圖片來自KC Roeyer/University of California, Berkeley。

　　2018年2月，X. Shawn Liu等人鑒于脆性X染色體綜合征是由患者X染色體上的FMR1基因發生突變引起，X. Shawn Liu等人開發一種移除甲基化的改進型CRISPR / Cas9系統：將沒有切割活性的dCas9與甲基胞嘧啶雙加氧酶Tet1融合在一起，移除FMR1基因中的三核苷酸（CGG）重復序列上的甲基化標簽[31]。移除這些甲基化標簽會讓FMR1基因的表達恢復到正常的水平。

　　2018年1月，Carsten Trevor Charlesworth等人分析了22名嬰兒和12名健康成年人的血液樣品以便確定這些人是否對這兩種最常用的Cas9酶版本---來自金黃色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）的Cas9酶（即SaCas9）和來自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9酶（SpCas9）---產生免疫反應，結果發現79％的研究參與者對SaCas9產生抗體， 65％的研究參與者對SpCas9產生抗體[32]。此外，Sojung Kim等人也發現體外轉錄的gRNA（in vitro transcribed gRNA, IVT gRNA）含有5’ 三磷酸（5'ppp）基團，這會觸發人細胞中的I型干擾素介導的免疫反應，以及干擾素激活的抗病毒效應蛋白（如DDX58）的表達增加，從而導致細胞死亡[33]。

圖片來自Genome Research, doi:10.1101/gr.231936.117。

　　其實，科學家們針對基因編輯領域的研究不勝枚舉，以上羅列的僅是其中的一小部分。當然，迄今為止，涉及基因編輯的疾病治療研究基本上局限在細胞模型和動物模型上，這是因為諸如CRISPR/Cas9之類的基因編輯技術存在著編輯效率較低和脫靶效應等缺點，因此貿然進行開展人體臨床試驗，會引發難以預測的結果，這不奇怪當中國科學家賀建奎聲稱世界上首批經過基因編輯的嬰兒出生時，國內外的口誅筆伐紛至杳來。不過，在未來，科學家們將從病理學、分子生物學、基因、蛋白和組學等不同角度深入探究ZFN、TALEN和不同類型的CRISPR/Cas系統及其改進版本等基因編輯技術的詳細作用機制，人們最終有朝一日能夠利用基因編輯技術治療HIV感染、癌癥、血液系統疾病、神經系統疾病和遺傳疾病等一系列疾病。

參考文獻：

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