幽門螺桿菌生物學性狀的研究
慢性胃病（B型胃炎、 胃潰瘍 等）及十二指腸球部潰瘍等一類常見病、多發病，長期以來，其病因尚未闡明。1983年澳大利亞學者Warren和Marshall從慢性活動性胃炎病人胃粘膜活檢標本中發現并分離出幽門螺桿菌（Helicobacter pylori Hp）后，引起了全世界消化病學與有關基礎科學的普遍關注。幾年來，各國對Hp的研究迅猛發展，其中主要為臨床實用性研究，有關Hp生物學特征相對較少，至于Hp具體致病機理則更少。
我們是從1985年開始與上海市消化疾病研究所合作開展這方面研究工作的，我們開初的工作（1985～1986）主要有：①在國內最早分離培養成功了Hp；②對上海地區各種慢性胃病中的Hp檢出率作了調查；③用雙盲法探討痢特靈、滅滴靈治療Hp陽性 慢性胃炎 的療效，并驗證Hp感染與慢性胃病人發病關系。上述研究結果表明：①我國Hp感染率與各種慢性胃病的關系和文獻報道的同樣廣泛和密切；②根據Hp的檢出率與各種慢性胃病的高度相關性、Hp感染者經適當藥物治療后與臨床癥狀緩解，以及病理表現改善的密切程度，支持慢性胃病的Hp感染學說。1988年，我們又用Hp超聲粉碎的抗原以ELISA法測定了Hp感染的 慢性胃炎 及消化性潰瘍病人、健康體檢者和新生兒血清中的抗Hp-IgG抗體，結果表明：①B型胃炎及消化性潰瘍病人的陽性率明顯高于A型胃炎及健康體檢組；②體檢組中抗Hp-IgG陽性率隨著年齡組的增長而升高，30歲～50歲組達最高峰，70歲以上又稍有下降，③新生兒組抗Hp-IgG陽性率反比1/2歲～10歲年齡組為高，接近成人水平。其抗體可能通過胎盤來自母體中，提示Hp是后天獲得感染。上述人群中，抗Hp-IgG抗體水平調查的結果又增強了慢性胃病的Hp感染之說。
1987年我們微生物學教研室以“彎曲菌樣細菌(Campylobacter-like organisms,CLOS)的生物學地位及致病物質的研究”課題名稱申請得到國家自然科學基金的資助。由此對Hp的生物學性狀作了比較全面系統的研究，企圖對Hp的生物學地位及致病機理作一些探討。
1 材料和方法
1.1 材料
①標本1985年5月～1989年10月分別取自上海市仁濟醫院、紡二醫院、新華醫院有上消化道主述病人的內窺鏡檢查標本。②菌種Hp均分自病人。除藥敏試驗和與空腸彎曲菌的交叉反應者外，都以88065，88073，88082，88109，88152五個菌株作為代表進行試驗研究。
參考菌種：空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni,CJ）CJ-3276株和結腸彎曲菌F（Campylobacter coli,CC）CC-3278株由法國Borbeaux兒童醫院Megraud 博士惠贈，空腸彎曲菌CJ-S131由蘇州醫學院微生物學教研室提供。胎兒彎曲菌（Campylobacter fetus,CF）日本大阪大學微生物學研究所三輪谷俊夫教授惠贈。
1.2 方法
1.2.1 光學顯微鏡檢查 取胃粘膜活檢標本或菌種培養物在潔凈玻片上涂薄膜。自然干燥，加熱固定，革蘭染色后油鏡檢查。另取胃粘膜活檢標本作石蠟包埋切片，四苯胺蘭（touidine blue）染色鏡檢。
1.2.2 分離培養 空腸彎曲菌選擇性基礎瓊脂（上海市衛生防疫站生產）中補充以10%羊血和1%可溶性淀粉，并每1000ml培養基中加入1ml萬古霉素（10mg/ml），1mlTMP(5 mg/ml)和1mloctidione(5 mg/ml)制成平板后，置Queue三氣培養箱（美國產），氣體調節至5%O2，85%N2和10%CO2，37°C培養3d后觀察。
1.2.3 生化鑒定 主要參考 Cliodna等方法：①氧化酶反應 用竹簽挑取血平板上可疑菌落至已被1%鹽酸二甲基對苯二胺（E.Mer-ck,Darmstadt產品）溶液浸透、并預先干燥過的濾紙上，10s內出現深紫紅色為陽性。②觸酶反應 用含3%H2O2液的毛細玻管碰觸血平板上菌落，有氣泡升起為陽性。③尿素酶反應 將含有菌落棉拭插入尿素肉湯中，30s內棉拭呈粉紅色為陽性。④DNA酶試驗 在含有甲葳胺蘭核酸瓊脂的平皿上打孔后，將細菌懸液加于孔中，37°C培養2h后觀察結果。小孔周圍出現透明小圈者為陽性。⑤堿性磷酸酶反應 用0.02mol/LpH8.0Tris-HCL洗下細菌菌落。加入0.5ml1%磷酸對硝基苯脂（Beckman產品），37°C水浴1 h ,觀察結果。呈黃色者為陽性。⑥亮氨酰胺肽酶反應 取小試管2只，1只測定管加待測菌液（約3×1010cfu/ml）0.05ml，另1只空白對照管加H2O0.05ml。然后各加0.2M磷酸緩沖液（pH7.2）0.45ml和基質液（亮氨酰-β-萘胺鹽酸20mg溶于H2O25ml，加入0.2mol/LpH7.2的磷酸緩沖液25ml，充分混勻）0.5ml。37°C水浴30min后各加入40%三氯醋酸0.2ml。充分混勻后4000r/min離心沉淀10min。從測定管和空白對照管中各取上清液0.5ml分別裝入另2只試管中，并分別加2NHCI0.5ml和0.2%NaNO20.5ml。充分混勻，室溫（20°C）中靜置10min。再各加0.5%氨基磺酸胺10ml。混勻后，室溫（20°C）靜置10min 。最后各加N-萘乙烯二胺二鹽酸鹽溶液[稱取N-（1-萘）乙烯二胺二鹽酸（分析純，瑞士，Lichtemptindicht生產）100mg，溶于95%乙醇200ml中，冰箱保存可穩定1個月。臨用時，以95%乙醇稀釋10位后使用] 2.0ml。20min后觀察結果。呈紫色為陽性。⑦馬尿酸鹽水解試驗 接種1環48hCJ/CC培養物或72hHp培養物于0.4ml含1%馬 尿酸鹽水溶液的小試管中，混勻，放置37°C水浴2h，再輕輕倒入0.2ml茚三酮 試劑 （3.5g茚三酮溶于100ml丙酮:丁醇=1:溶液）于各管。置37°C水浴，經 10min后看結果。深紫色為陽性反應。
1.2.4 抗菌藥物敏感性試驗 用瓊脂稀釋法測定13種抗菌物（青霉素G、鏈霉素、慶大霉素、紅霉素、先鋒霉素V、四環素、痢特靈、滅滴靈、TMP、潔霉素、次硝酸鉍、多粘菌素B、萬古霉素）對30個（Hp）菌株（Hp菌株號：85025，85084，85114，85117，85120，85143，85187，85485，85507，85508，85524，85553，85558，85560，85562，85568，85596，85595，85621，85623，85625，85629，85634，85639，85643，85647，85648，85660，85663，85677）的最小抑菌濃度（Minimal inhibition Concentration,MIC）。①菌液準備：待測菌株落分別用生理鹽水洗下，比濁調整至108fu/ml。②藥敏平板制備：分別取200ul不同種類、不同濃度的抗菌藥物稀釋（抗菌藥物的濃度為0.05μg～100μg/ml的對倍稀釋液的對倍稀釋系列）置于空的無菌平皿（φ9 cm）中。每只平皿加入加熱融化的血瓊脂10ml，輕輕搖動使培養基與抗菌藥物均勻混合。待瓊脂凝固后備用。③細菌拉種：用多點接種器（M2T-P）將菌液點種于上述每只藥皿平板上。每個平板點種25個菌種。置微需氧環境中培養3d后觀察結果。如Hp在某個抗菌藥物濃度的培養基上生長，而在前一個大一倍的嘗試的培養基上不長，則以此前一個平板中的抗菌藥物嘗試為該菌的MIC。
1.2.5 菌種保存 挑取3～5環分純的Hp菌種（菌號：88064，88065，88073，88075，88077，88082，88099，88108，88109，88152，88223，85289，85682，85688）于裝有滅菌脫脂牛奶的Eppendorf塑料 離心管 ，置-70°C凍存。經1年后復蘇鑒定。
1.3 超微結構的研究
以Hp88065，88073，88082，88109，88152菌株及CJ-3276，CJ-131、CC3278參考菌株制成負染和超薄切片，置H-500透射電鏡下觀察。取新鮮采集的胃粘膜活檢標本經固定后在臨界點下干燥，真空涂金。在JEOL JSM0S40掃描電鏡下觀察。
1.4 Hp的DNA G+Cmol%與菌體脂肪酸組成測定
1.4.1 細菌DNA中G+Cmol%含量的測定 主要參贊丁鑒等高壓液相 色譜 測定。①Hp DNA的提取；將細菌懸液經4000e/min×15離心沉淀，用0.15mol/LnaCI-0.1M EDTA pH8.0 溶液（SE液）洗一次后，重懸浮于10mlSE液中。加溶菌酶，使終濃度為2％的SDS，放60°C水浴15min。用等體積酚／氯仿?異戊醇（體積之比為3/1）抽提二次后，再用等體積氯仿/異戊醇（體積之比為24/1）和等體積乙醚各抽提一次。水相在pH7.8,10mmol/L Tris-HCI,1mmol/L ED-TA中透析4°C過夜。透析后的抽提液中加入經100°C、15min處理的Rnase，使終嘗試為200ug/ml，37°C,2h。加蛋白酶K，終嘗試為200ug/ml，37°C輕搖2h。用等體積酚/氯仿（體積之比為1/1）和等體積氯仿?異戊醇各抽提一次。水相加NaCl和0.1M，溶解后，加入