2結果
2.1多重PCR方法的反應結果應用多重PCR方法可以鑒定不同的RHD基因型(圖2)。根據擴增條帶判斷結果，D/d型：目標條帶為3條，分別為208bp、263bp和1920bp;d/d型：目標條帶為2條，分別為208bp和1920bp;D/D型：目標條帶為2條，分別為208bp和263bp;DEL/d：目標條帶為4條，分別為102bp、208bp、263bp和1920bp;由圖2可知，本實驗室所建立的實驗方法，具有簡便直觀，鑒定準確的特點，可以檢測出人類RHD基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型，適于大樣本量的篩選和檢測。圖2多重PCR方法檢測RHD基因型的電泳圖 Fig.2 Electrophoretogram of RHD genotypes by the multiplex PCRM：Marker(DL2000)，購自TaKaRa公司;1、2：INNO-TRAIN公司的標準物，1為D/d型，2為d/d型;3：D/D型;4：D/d型;5：DEL/d型;6：d/d型;7：DEL/d型;8為d/d型。
2.2本方法與商用試劑盒的對照結果應用德國INNO-TRAIN公司和天津市秀鵬生物技術開發有限公司RHD基因檢測方法進行相同樣本的基因分型(圖3、圖4)，按照條帶布局判斷結果，檢測結果與本實驗室的方法結果相符。與商用試劑盒相比，自建方法只需要在凝膠中加1孔的反應產物電泳后即可判斷結果，而商用試劑盒需要8孔通過格局來判斷結果，自建方法明顯較為簡便。圖3INNO-TRAIN公司試劑盒RHD基因分型的電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of RHD genotypes by commercially supplied kit from INNO-TRAIN CompanyA、C：購自INNO-TRAIN公司的標準物;A：D/d型;B：D/D型;C：d/d型;D：d/d型;E、F：DEL/d型。
2.3應用本方法檢測Rh陰性無償獻血者基因型的結果共篩選了437例西安市Rh陰性無償獻血者的基因型，檢出DEL/d基因型88例，占Rh陰性無償獻血者20%，無效D基因型(即有D基因但不表達D抗原，基因型為D/D和D/d)33例，占7.5%。采用本方法可以直觀和高通量地檢測Rh血型的基因型(圖5)。為保證實驗的準確性，避免假陰性和假陽性，在檢測樣本中加入已知RHD基因型的質控樣本，圖中C1(DEL/d型)、C2(d/d型)和C3(D/d型)即為質控樣本，根據其反應結果判斷實驗結果是否可靠。圖4天津市秀鵬公司試劑盒RHD基因分型的電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of RHD genotypes by commercially supplied kit from Tianjin Biosuper Company圖5西安市RhD陰性無償獻血者基因檢測的電泳圖 Fig.5 Electrophoretogram of RHD genotypes for RhD negative donor in XianC1：DEL/d型;C2：d/d型;C3：D/d型。
3討論
20世紀90年代，隨著分子生物學技術的發展， 血型基因分型已廣泛應用于ABO基因分型。例如胎兒、新生兒血紅細胞ABO血型的鑒定[4];由于RH基因的復雜性，RH基因的研究起步較晚，隨著科研人員的努力，RH基因的位置和序列都已經被逐步確定下來。Rh抗原是由位于1號染色體短臂上的兩個同源及緊密連鎖的基因所編碼，即RHD和RHCE基因，每個基因都是由10個外顯子組成;RHD基因編碼D抗原，RHCE基因編碼Cc和Ee抗原。RHD和RHCE基因的外顯子與內含子有93.8%的同源性。RHD和RHCE基因分別長57295bp和57831bp，兩個基因相隔約30kb，尾對尾形成排列(5′RHD3′-3′RHCE5′)，中間隔差一個功能未知的小膜蛋白1基因(SMP1基因)。RHD基因的兩端存在有兩個具有98.6%同源性的區域被稱為Rh盒子(Rh boxes);RhD陰性的RHD基因缺失，兩端的Rh boxes基因部分缺失后熔合形成單一雜合Rh盒子(Rh box-hybrid)，成為RhD陰性基因的特征[5]。RHD和RHCE基因的高度相似性使通過分子生物學進行基因檢測的難度增加，要建立準確的基因分型的方法，必須要避免相似基因造成的非特異性。因此，設計出的引物必須能夠特異性地擴增出RHD基因而非RHCE基因，同時還能夠對不同的RHD基因型加以區分。
現已發現RhD陰性的個體中存在著一種重要的RhD的弱表現型：DEL(D-elution)型，DEL所占的比例在不同文獻報告中不盡相同。國外報告在黑人和日本人中DEL比例較高，約30%～50%，中國人初篩RhD陰性的人群中香港報告DEL占30%，內地占20%～30%[6-7]。DEL血型引起了日益增加的關注主要源于兩個方面：一是目前國內外對DEL血型作為RhD陰性血型對待，DEL血液仍用于供給RhD陰性患者使用。但是，國內外都有越來越多的報道證實RhD陰性患者輸用DEL血液后，產生了抗-D抗體或體內抗-D抗體效價升高，可能引起輸血反應，成為臨床輸血中的不安全因素;二是DEL表達的D抗原是完整的D抗原，DEL血型的患者是否能夠用D陽性血液，從而節約寶貴的RhD陰性血液資源[8]。以上的研究都必須對DEL血型進行準確的鑒定，同時大規模的檢測也需要采用可靠、簡便和經濟的方法才能夠進行。因此，我們建立的方法對開展進一步的研究具有實際價值。
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