3.7 全長突變體的構建
優化的 N△5-S3/6 被再延長來研究突變對被截切后的不穩定蛋白質的互補作用。根據圖 16.2A，被截切的氨基酸重新被加上，從而得到全長基因——被命名為 FL-S3/6 的克隆。這個突變體定位在細胞間質，在 E.coli XL-1 Blue 中表達來檢測體內功能。讓人意外的是，在含氯霉素和 100 μg/ml 氨芐板上于 37°C 20 h 生長的克隆數目只有不含氨芐的對照板上的 50%。這和 N△5-S 3/6 在兩個板上得到相同數目克隆成鮮明對比。為了研究蛋白質
功能和蛋白質定位，對 FL-S 3/6 和 N△5 - S3/6 的細胞粗提液做酶活反應。沒有看到對發色底物頭孢硝噻吩的水解反應的區別，說明酶的定位是很重要的。與這些數據相符合的是在 FL- S 3/6 的純化過程中也能看到信號肽剪切的減少（見 16.3.8)。因此，可在細胞質內表達的 FL- S3/6-cyt 被克隆，該克隆用甲硫氨酸替代了信號肽以及Asp- Gly tag。為了保證在生理條件下正確的對比，與野生型內酰胺酶類似的基因（wt- done-cyt) 也被克隆。
3.8 蛋白質表達及純化
β-內酰胺酶突變體（野生型間質定位的、野生型胞質定位的、N△5、優化的 N△5-S3/6、N△5- S5/S7 和 FL-S3/6 胞質定位的突變體）在 lac 啟動子下于 E.coli 細胞中帶 His -tag 融合表達（見 16.3.8.1)。通過兩步純化反應進行純化，首先用底物相似的親和層析苯基硼酸鹽柱子（見 16.3.8.2 )，再用 IMAC ( 見 16.3.8.3 )。這種純化步驟非
常適用于 N△5 (圖 16. 5 ) 和 N△5- S3/7 突變體的純化。
對于某些 β-內酰胺酶突變體（野生型、N△5- S3/6、FL-S3/6)，其純化的蛋白質有很高的污染并呈未加工完全的形態（30%~ 65% ; 見注 7 )，極可能是因為過表達或者折疊太快造成的。由于即使是對旨在高產率的細胞間質提取物純化也會引入污染，所以疏水親和層析（ HIC ) 被用來將蛋白質的自然形態與那些疏水性極高的未加工完全
的蛋白質形態分離開來（見 16.3.8.4)。
細胞質表達的 β-內酰胺酶變體 wt-clone-cyt 和 FL-S3/6-cyt 用苯基硼酸鹽親和柱和 IMAC 進行純化。可用離子交換柱進一步純化（見 16.3.8.5) 。
3.8.1 蛋白質表達和細胞破碎
( 1 ) 將質粒轉化到合適的表達菌株（如 BL21)
( 2 ) 從甘油菌挑菌到 2YT/Cm 培養液中，在 28°C 培養 16~18 h ( 見注8 ) 。
( 3 ) 用過夜菌擴培 4 個 1L-2YT/Cm 培養液，起初 OD600 為 0.15，在 24°C 培養 N△5 克隆，在 25~30°C 培養其他克隆（見注 9 )。
( 4 ) OD600 為 0.7 時，用 0.5 mmol/L IPTG 誘導細胞。誘導 40 min 后，加入 100 μg/ml 氨芐來篩選表達內酰胺酶的細胞。
( 5 ) 誘導 4~5 h 后（OD600 為 4~5)，用 GS-3 轉子收菌，在 -80°C 凍存。
( 6 ) 為了純化，將菌（1 L 表達菌液）懸浮在懸浮緩沖液（見注 10 ) 中，加入 200 U 的 benzonase 酶。
( 7 ) 在 97MPa ( 約 14000 psi) 下反復循環 6 次破碎預冷細胞，要一直將樣品放在冰上。
( 8 ) 將上清液用 SS-34 轉子離心，41000 g，離心 40 min。用 0.45 μm 磺酸多醚注射過濾器過濾上清液。
3.8.2 苯硼酸親和層析柱
( 1 ) 將 2 ml 苯硼酸鹽柱用懸浮緩沖液懸浮，將 16.3.8.1 步驟（8 ) 中得到的上清液上樣到親和柱中，用懸浮緩沖液沖洗直到 280 mn 的吸收達到基線。
( 2 ) 用硼酸緩沖液洗脫 β-內酰胺酶突變體。
( 3 ) 用 12.5% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE) 來鑒定蛋白質純度，用考馬斯亮藍染色。
3.8.3 金屬親和柱
( 1 ) 用含 5 mmol/L 咪唑或不含咪唑的磷酸緩沖液平衡 4 ml Ni-NTA 柱子，然后將 16.3.8.2 步驟（2 ) 的樣品上柱。
( 2 ) 用含咪唑分別為（5%、10%、16% 和 100% ) 的梯度緩沖液洗脫樣品。
( 3 ) 用 12.5% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE) 來鑒定蛋白質純度，用考馬斯亮藍染色。
( 4 ) 為了進一步純化，在含有 1 mmol/L EDTA 的 1 L 磷酸緩沖液中透析純化的蛋白質（約 8 h)，重復 3 次。
3.8.4 疏水作用色譜法
( 1 ) 用 1 mol/L (NH4)2SO4 平衡 1 ml 苯基硼酸鹽柱。
( 2 ) 將 16.3.8.3 步驟（2 ) 或 16.3.8.2 步驟（2 ) 得到的樣品加入硫酸氨到終濃度為 1 mol/L (NH4)2SO4 (見注 11)，離心（10 min；27000 g；4°C；SSr-34 轉子）并過濾（ 0.45 μm 過濾器）用以制備澄清樣品。
( 3 ) 將樣品上樣到 HIC 柱子上，用 30 ml 含 0~100% 0.5X 磷酸的線性梯度緩沖液沖洗。疏水越強的部分與柱子結合越緊密。
( 4 ) 如果是苯基硼酸鹽親和層析后直接上 HIC 柱子，樣品需要進一步用 IMAC 來純化（見 16.3.8.3)。
3.8.5 離子交換層析
( 1 ) 將 16.3.8.3 步驟 (2) 中得到的樣品在 1~1.5 L Tris-HCl 緩沖液中透析 3~4 次。
( 2 ) 用 Tris-HCl 緩沖液平衡 Mono Q 離子交換柱并上樣。
( 3 ) 用 30 ml 0~100% Tris-HCl-NaCl 線性梯度 0~100% 緩沖液洗脫。
( 4 ) 將洗脫得到的樣品用節 16.3.8.3 步驟（4 ) 所述方法透析。
所有突變體的氨基酸組成由電噴霧質譜法分析得以證實其符合計算質量的偏差范圍。酶按照節 16.3.8.3 步驟（4 ) 所述方法透析，并在純化一周內進行鑒定。在用之前，酶液需要用離心方法（30 min；15000 g；10°C ) 澄清，蛋白質濃度由在 280 nm 處的吸收光譜測定（見注 12)。
3.9 酶活反應
β-內酰胺酶突變體酶活反應參數是根據發色底物頭孢硝噻吩在 486 nm 的光譜來測定的。
( 1 ) 在 980 μl 頭孢硝噻吩溶液中加入 20 μl 酶的稀釋液，混合均勻后立即在 486 nm 處測定在大約 1 min 內的吸收值的變化（見注 13)。對于起始缺失突變，我們采用的酶的終濃度為 2.5 nmol/L，對于其他變體則為 0.5 nmol/L。
( 2 ) 上述測定過程被重復至少兩次并計算標準偏差。
動力學常數是在 25°C 下，在含 0.5% 二甲基亞砜的 50 mmol/L 的磷酸鉀緩沖液 ( pH 7.0 ) 中，以 β-內酰胺化合物頭孢硝噻吩為底物測定的。
3.9.1 米氏常數的測定及轉化率的計算
( 1 ) 為了測定米氏常數（KM )，反應初速率是在底物濃度為 10~500 μmol/L 時，用 2.7~5.9 nmol/L 的 N△5 或 0.5 nmol/L 其他變體來測量完成的。
( 2 ) 將數據輸入到米氏方程，如用程序 SigmaPlot (SPSS) 提供的 MarquardtLevenberg 運算法來得到。
N△5 的 KM 值與野生型相比沒有變化，但是轉化率 K 降低了 6 倍，表明活性位點的構成對底物的結合是充分的，但并不能使有效的催化反應發生（表 16.2 )。
3.9.2 熱活性描述及半衰期
為了檢測和比較對溫度依賴的活性和熱誘導失活的動力學參數，進行了熱活性篩選。我們測定了在 25~70°C 溫度范圍提高溫度時反應的轉化率（圖 16.6)。
( 1 ) 為了檢測熱活性，配制 292 nmol/L 的 N△5 突變體溶液及 25 nmol/L 的其他突變體溶液，并分裝成 3 等份。
( 2 ) 將第一等份在已給定溫度下（25~70°C ) 的水浴中放置 5 min。其余兩等份仍在冰上保存。
( 3 ) 在檢測之前，輕微的將樣品混勻。
( 4 ) 將 20 μl 樣品加入到 980 μl 提前在反應溫度下預熱的頭孢硝噻吩溶液中，反應初速度在 5?25 s 由加熱的光譜儀測得。
( 5 ) 將第二等份在相應的溫度下預熱 30s，然后按照步驟 （3 ) 和（4 ) 所述測酶活。
( 6 ) 把第三等份在冰上放置 10 min 后測酶活。
( 7 ) 將上述步驟在不同溫度下進行重復。
野生型的熱活性主要依賴于預熱處理（圖 16.6A )。在冰上放置或預熱 30 s 的酶，其反應的最優溫度是 40°C。然而，當酶預熱 5 min 后，其最優反應溫度降至 35°C，這表明溫度依賴的去折疊的出現。
N△5 突變體在 25°C ( 所檢測的最低溫度）下有最高酶反應活性（圖 16.6C）。隨著溫度的升高，酶活迅速降低，當達到 40°C 時，酶活為零。一個詳細的在冰上溫浴后在 40°C 下測酶活實驗表明，酶是在檢測過程中被熱失活的，而且發生在將酶加入反應液后的僅數秒內（圖 16.7A )。隨著溫度的升高，酶活降低，通過指數衰減公式（見注14)，可算得半衰期在 40°C 下為 7s ( 圖 16.7B)。N△5-S3/6 突變體在 0s 和 30s 的熱活性與野生型很相似。然而，5 min 預熱后的情況則很不一樣。與野生型相比，N△5-S3/6 突變體的熱活性提高大約 8℃ ( 圖 16.6 A 和 F )。
全長的優化突變體 FL-S3/6-cyt ( 圖 16.6 E ) 展示了比優化缺失突變體 N△5-S3/6 以及相應的野生型 wt-clone-cyt 更好的熱穩定性（圖 16.6 B 和 F) 。這些酶的活性在 40°C 以內很相似，而與預熱與否關系不大。在溫度高于 50°C 時，FL-S 3/6-cy 保持了顯著較高的酶反應活性，尤其在延長熱壓力到預熱 5 min 的情況下。在冰上放置的野生型胞質內酰胺酶的最佳催化活性是在 45°C 下，而預熱 5 min 后則降到 35°C。與之相比，FL-S 3/6-cyt 的最佳溫度（50°C ) 則保持不變。只是溫浴后的反應速率有所下降。有意思的是，野生型和胞質野生型內酰胺酶的 N 端氨基酸（Met 取代 AspGly) 的轉換影響著酶的穩定性。
對所有截切突變體和全長突變體的 5 min 預熱后的熱活性的比較（圖 16.6F) 闡明了末端截切是怎樣在 35?40°C 使活性減小的。補償氨基酸后能夠使活性得以恢復，甚至提高穩定性。經過再延長優化了的 S 3/6 突變體進一步提高了酶的熱穩定性和熱活性。
3.10 尿素誘導的去折疊和數據分析
β-內酰胺酶突變體的去折疊是通過熒光分光光度計來檢測的。色氨酸固有的最大熒光發射值的紅移作為與尿素濃度相關的函數來測定（圖 16.8，表 16.3 )。根據三態模型進行數據分析。
( 1 ) 將 300~400 nmol/L 的酶溶液 [ 見 16.3.8.3 ( 4 ) ] 用 0.25~8 mol/L 的尿素在 19°C 下平衡 18~20 h。
( 2 ) 在 20~23°C，記錄 320~380 nm 的突光發射被譜。對每個數據點來說，平均掃描 4 次。
( 3 ) 如果需要，則根據溶液（含有變性劑的磷酸緩沖液）背景熒光來校正熒光光譜。
( 4 ) 從熒光強度譜中算出 λmax 值。我們運用了程序 SiigmaPlot ( 見注 15 ) 中的權重功能（tribute weighting) 來完成此計算。
( 5 ) 分析假定得到的合適去折疊模型的數據。
蛋白質的變性（圖 16.8，見注 17 ) 與熱活性（圖 16.6，16.3.9.2 ) 是相吻合的。穩定性最不好的是 N△5 突變體，然后是野生型胞質內酰胺酶。優化的突變體 N△5 -S3/6 和 N△5 -S3/7 在相同的尿素濃度下開始去折疊，被延長的 FL-S3/6 突變體是最后一個去折疊的。
野生型胞質內酰胺酶和 N△5 的去折疊表現了很明顯的三態去折疊。FL/S3-6-cyt 突變體數據也表現了很好的三態去折疊。N△5-S3/6 和 N△5-S3/7 突變體數據既可以用二態，也可以用三態去折疊來解釋。相比而言，所有的數據都能用三態模型 NIU，式( 1 ) (步驟（6 )，表 16. 3 ) 來解釋。這種方法由以前 TEM - 1 β -內酰胺酶去折疊中間態折疊模型支持 [42~44] 。尿素處理后第一次變性的酶顯示了降低的活性。從中得到的熱力學值可以幫助比較和解釋所得的突變體，但需謹慎使用，因為這是在假設的基礎上得到的。去掉前 5 個 N 端的氨基酸（主要影響第一過渡態），穩定性被降低 10 kJ/mol，對第二過渡態的影響不大。催化活性的體內優化得到對兩個過渡態都有穩定作用的突變體，所得突變體在第一過渡態的穩定性在野生型之下，而第二過渡態的穩定性則在其之上。與 N△5-S3/6 相比，延長的 FL-3/6-cyt 明顯穩定了第一階段（19.6 kJ/mol)，但對第二階段的影響不大（3.8 kJ/mol)。這與延長補償截切突變體不受引入突變的干擾的現象是相符合的。與野生型胞質內酰胺酶 wt- clone-cyt 相比，FL_S3/6-cyt 的穩定性在第一過渡態增加了 15 kJ/mol，在第二次過渡增加了 11.4 kJ/mol。需要注意的是優化的突變體與野生型相比在更高的尿素濃度下才會變性，證實了在熱活性實驗中觀察到的穩定性排序