| 實驗步驟 |
本章主要介紹提高蛋白質熱穩定性的常規方法，而不需要在高溫下篩選酶活性。介紹完
β 內酰胺酶模型系統（見 16.3.1 )，我們描述末端截切（見 16.3.2 和 16.3.3 ) 的設計方案，它們對酶活的影響（見
16.3.4 )。突變庫由酶的定向進化和錯誤向 PCR 產生（見 16.3.5)，然后在體內應用不同的篩選壓力進行篩選（見
16.3.6)。在本節的最后一部分討論截切突變體的再延長（見 16.3.7)、表達策略和純化方案、酶學方法 ( 見 16.3.9 )
以及穩定性檢測（見 16.3.10)。
3.1 β-內酰胺酶模型系統
為了說明截切-
優化-再延長可以用來提高蛋白質的熱穩定性，內酰胺酶被選作模型系統（圖 16.1A
)。作為一個臨床發病機制相關的研究因子和重要的抗體，它所屬的家族已被廣泛研究，多個晶體結構已解析。許多對該酶的突變已被用于更好地研究和解釋結構-功能相關性以及理性設計截切片段。此外，穩定的
β-內酰胺酶還被用于癌癥治療的潛在藥物的活性研究，以便得到潛在的藥物前體化合物 [ 27，28 ] 。
β-內酰胺酶的 A
家族（EC 3.5.2.6 ) 是細菌胞質酶，其氨基酸序列多樣化，穩定性不同，但其三維結構很相似。盡管 β-內酰胺酶的 A
家族的肽主鏈在核心區能很好地重疊在一起，但在兩個末端并沒有很好的重疊性。末端結構的不同也與氨基酸長度和氨基酸組成相符合，讓這類酶適合于研究序列同源和功能的相關重要性。
3.2 設計末端截切
缺失突變體的正確設計很重要：如果末端截切的過多，由于結構穩定性不夠和錯誤折疊，其得到的截切突變體將沒有功能；同樣，如果截切的不夠多，很有可能得不到期望的表型，選擇壓力將無法選擇出穩定的結構。
如果目標蛋白的結構已被解析，可用
Protein Data Bank (PDB；http : //www.pdb.org/)，SWISSPROT ( http ：
//www. expasy. org/sprot/和 http : //www.ebi. ac.uk/swissprot) 以及
SCOP ( http : //scop. mrc-lmb. cam . ac . uk/ scop/ )
等數據庫以及結構分析工具，如分子模型程序 WHATIF (http : //swift cmbi.
kuru nl/WIWWWI) 和
CE 運算法（http : //cl. sdsc . edu /ce . html)
，來進行結構比較和分析。另外，接觸圖可用作識別可能的非重要和重要的相互作用，這些在設計過程也很重要。如果沒有高分辨結構，可用其他的數據 庫（如
HSSP) 和 SWISS MODEL 同源模型服務器（http : //swissmodel. expasy. org) ,
或者用一個或兩個氨
基酸逐切來決定最大截切數。
在該研究中，根據以前的 β-內酰胺酶的突變體研究 [29] 而設計 4
個截切突變體，對 β-內酰胺酶的 A 家族進行結構同源序列比對，用 CE 運算法 [ 30 ] 和 SWIS& PDB 瀏覽器 [31]
(http : //ww w. expasy. org/spdbv) ( 圖 16.1B 和圖 16.1C)
來分析結構。截切的突變體試圖在生理溫度下引入結構干擾而不會使蛋白質完全沒有功能。N 端前 3 個氨基酸（ His、Pro 和 Glu)
有很高的溫度因子（高達 23.8A，平均 13.1A )和溶劑可接觸性（PDB 號1btl )，當去掉前 3 個氨基酸得到的突變體 N△3
對蛋白質穩定性的影響比較小。N△5 突變體去掉臨近的蘇氨酸和亮氨酸，其中蘇氨酸被完全掩蓋并與 C 端的 Ser285 氨基酸形成氫鍵。在 C
端，只有 1 個和 3 個氨基酸被去掉 （突變體 C△1 和 C△3 )，因為以前的研究表明末端酪氨酸是關鍵的氨基酸 [32] 。
3. 載體質粒的設計
載體質粒被設計為當野生型
β-內酰胺酶或截切的突變體與用于細胞間質定位的 N 端 pelB 信號序列融合表達。一 個短的天冬氨酸-甘氨酸的鏈接被引入用來確保 N
端不同的突變體同等的處理效率。最后，C 端連接 His-tag 可用于固定金屬離子親和柱來純化，甚至能夠純化非野生型的 β-內酰胺酶變體（圖
16.2A)。
載體構建步驟如下：
(
1 ) TEM-1β-內酰胺酶截切突變體 NA3、N△5 和 C△1 及 C△3 是由 pUC 衍生的 TEM-1
基因擴增而來，分別用其正向和反向引物。正向引物含 5' Sfi I 酶切位點，還包含 pelB 信號肽鏈的 C 端編碼序列和 TEM-1
截切突變體的 N 端修飾（截切）序列。在基因的 3' 端，包含反向序列編碼改造的 TEM-1 的 C 端序列、1 個短的序列（2
個甘氨酸殘基）、5 個 His-tag、2 個終止密碼子和 Hind lll 酶切位點。
( 2 ) 其 PCR 產物由 Sfi I/Hind III 雙酶切、純化，然后克隆到 pKMENGRbla (由 K.M.M. 提供）載體中，pKMENGRbla 是由表達載體 pKA400 [ 26 ] 改造而來，含有 1 個氯霉素抗性基因。
得到的質粒（pKJE_Bla—NA/CA
系列）在 lac 操縱子下表達了各種 TEM-1 突變體基因。盡管質粒上的 lacI 有組成型表達，強的 T7g10
Shine-Dalgarno 序列 [ 35 ] 有很高的表達水平，因此所有選擇步驟在極端條件下進行，并未過表達。
3.4 末端截切對酶活性的影響
為了檢測末端截切對酶活性的影響，在氨芐抗性遞增的固體培養基和液體培養基中測其生長速度。通常，在固體板上的篩選比液體狀態下更為苛刻。通過本底表達及 IPTG 誘導表達以及在不同溫度下的誘導來觀察體系的不同。
( 1 ) 如果有需要，用標準方法轉化 BL21 細胞涂在 LB/Cm 板上。
( 2 ) 從甘油菌或者轉化的過夜（16 h) 培養的 LB/Cm 板上 [ 步驟（1 ) ] 挑取單克隆。
( 3 ) 將過夜培養的菌，在新培養基中稀釋至 OD600 為 0.1，并將其培養至 OD600 為 1 ( 見注 1)。
( 4 ) 將預培養的菌液 [ 步驟（3 ) ] 涂在含 IPTG 與不含 IPTG 的不同濃度的氨芐抗性板上。被涂的菌量可估量為 2.5X108 個細胞/ml，1 個 OD600。
( 5 ) 在液體 LB/Cm 培養基中加入步驟（3 ) 的菌液，在含 IPTG 與不含 IPTG 的不同濃度的氨芐培養基中培養。
( 6 ) 生長速率 [ 步驟（4 ) 和（5 ) ] 可以在不同溫度下重復。
在不誘導情況下，于固體板上
37°C 培養，當氨芐抗性濃度從 0 μg/ml 增加到 50 μg/ml 時，所有截切突變體的克隆數急劇減少（圖 16.2B) 。在連續培養
40 h 后突變體 N△5 和 C△3 沒有長出克隆，說明了末端氨基酸的重要性。當 25°C 誘導時，N△5 能夠在高達 50 μg/ml
的氨芐固體培養基中生長，在 37°C
液體培養基中在合適的供氧情況下仍能生長。這說明兩個截切突變體都能干擾蛋白質結構，但同時可以折疊成有活性的結構。N△5 突變體比 C△3
對抗生素的容忍性更小，因此更適合于下一步的優化。
3.5 DNA 混編和隨機突變
逆轉由末端截切或刪除突變造成的結構干擾的關鍵優化步驟是在遺傳水平上建立高度可變的突變庫。隨機突變與 DNA 重組的結合能夠滿足這樣的突變需求。
DNA
混編 [ 15，16 ] 是在試管里進行 DNA 重組的廣泛應用的方法。由 DNA
混編方法將不同源的基因混雜在一起是定向進化中的關鍵步驟，其主要特點簡述如下：在全基因上進行隨機點突變后，主要是由易錯 PCR ( 見
16.3.7 ) 引入突變得到的突變庫可用來 DNA 片段化，從而得到小的、略微不同的、可相互交換的、長度為 50~200 個堿基對的 DNA
片段。將一個或多個核苷酸不同的同源序列交迭并用 PCR 重新擴增成長片
段，起初用低溫退火來確保最小的片段也能夠進行 PCR。隨著循環次數的增加，將退火溫度逐步提髙來選擇長的交迭片段。最后，用基因兩側的引物合成全長的基因，并引入合適的酶切位點進行下一步的克隆。
以下內容介紹用易錯
PCR 和 DNA
混編來創建有足夠復雜度、多樣化的突變庫。值得注意的是，這里介紹的步驟只針對我們的系統，隨著目標基因的長度和組成需要有所改變。需要考慮在易錯
PCR 引進突變之前反應的覆蓋率，第一次隨機突變，第二次組合是不能用來決定混編過程中的錯誤率的（見注 2 )。
( 1 )
得到足夠量（5~10 μg）的目標基因，可用目標基因兩端的同源序列 PCR 或者用限制性內切核酸酶基因末端剪切。如果用 PCR 方法，應該用
Taq DNA 聚合酶來合成產物。在我們的例子中，我們以 pKJE_Bla_N△5 為模板，用引物 Pr_sfi_pelB_DG_ shuffl
和 Pr_GG_his5 _ hind_shuffl 擴增截切的 β-內酰胺酶。
( 2 ) 將 4~5 μg 的目標基因用 0.2 U 的 DNase l 在 50 μl DNaSe I 的酶切體系中，于室溫（25°C) 下酶切 12 min。
( 3 ) 加入 4 μl 的 EDTA 溶液終止內切酶反應，并在冰上放置。
( 4 ) 將得到的 DNA 片段在 2% 的瓊脂膠上分析并回收長度為 50~150 bp 的 DNA 片段。
( 5 ) 用 Qiaex II 膠回收試劑盒回收 DNA 片段（見注 3)。
( 6 ) 在 50 μl 體系中，加入約 100~300 μg 的純化的片段用來作引物延伸 PCR ( 見注 4)。反應混合物包括 2.5 U DNA 聚合酶、0.4 mmol/L dNTP 2 mmol/L MgCl2。在
PCR 儀（Eppendorf) 中，PCR 反應用以下程序進行：94°C 3min；94°C 1 min ( 變性），（ 45 + 0.3
)°C 每個循環 1 min (退火），72°C 1 min (延伸）（10 個循環）；最后一個循環后 72°C 5 min；94°C 1
min，（50+0.4)°C 每個循環 1 min，72°C 1 min (15 個循環）；最后一個循環后 72°C 5 min；94°C 1
min，（56+0.5)°C 每個循環 1 min，72°C 1 min (10 個循環）；最后一
個循環后 72°C 5
min；94°C 1 min， ( 61 + 0.5 )°C 每個循環 2 min，72°C 2 min (10 個循環）；最后一個循環后
72°C 5 min。另外，一個簡單程序，如 94°C 3 min，35 個循環：92°C 30s，(30 + 1 )°C 每個循環 1 min
，72°C 1 min + 4s/循環，最后一個循環后 72°C 5 min。
( 7 ) 擴增 1/5 體積的重疊的 PCR
反應物（不需要純化）來擴增全長基因，并加入合適的酶切位點以便下一步克隆。這步可在易錯傾向條件下進行，以便擴增突變庫的多樣化。除了用 Taq
DNA 聚合酶延長外，擴增反應的突變率可通過 7 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L MnCl2 的加入而提高( 見注5)。在我們的例子中，我們用引物 Pr_sfi_
pelB_DG_shuffl 和 Pr_GG_his5_hind_shuffl，每條引物的濃度是 0.5 μmol/L。反應混合物包括 7 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L MnCl2、0.4 mmol/L dNTP 和 2.5U Tag。所用的程序是 94°C 3 min，25 個循環：94°C 1 min , 68°C 1 min，72°C 1 min，最后一個循環后 72°C 7 min。
( 8 ) 用 GFX PCR DNA 和切膠回收試劑盒來純化 PCR 產物，用合適的酶酶切產物，克隆到表達載體中。用16.3.6 所述方法進行轉化。
我們進行了 3 個循環的定向進化（S1~S3)，用 DNA 混編和隨機突變并結合體內篩選過程。所得到的克隆被收集，作為下一步進化的模板。在定向進化的最后一個循環中，DNA 混編后的易錯 PCR 被標準的 PCR 程序取代，防止在重組的克隆中產生有害突變。
16.3.6 轉化及在體內篩選突變庫
( 1 ) 把質粒突變庫，用丁醇沉淀。用 10~20 μl 連接混合物，加入雙倍量的去離子水使體積達到 50 μl。加入 500 μl 丁醇在室溫離心 2000 g，30 min。去掉上清液，在室溫晾干，加入 10~20 μl 的水。
( 2 ) 將沉淀后的 DNA 加入到 100 μl 電轉感受態 E.coli XL-1 藍細胞中。1.7 kV，200Ω，25 μF。轉化完后立即加入 900 μl 的 2YT 培養基和 1/100 體積的轉化鹽儲液。
( 3 ) 將懸浮的細胞加入 10 ml 玻璃試管中，在 37°C 培養 60~70 min。
( 4 ) 通過將轉化產物逐步稀釋涂在 LB/Cm 板上來檢測轉化效率。
( 5 ) 用另一管轉化的細胞涂在不同濃度的氨芐抗性 LB/Cm 板上來檢測篩選壓力( 見注 6)。選擇在最高氨芐濃度下長出來的突變體來進行下一步實驗。
(
6 ) 作為篩選，把轉化的細胞涂在不同濃度的氨芐抗性 LB/Cm 板上 [ 由步驟（5 )得到的濃度 ] ( 見注 6
)。我們用的氨芐在第一到第三次篩選的濃度分別為 20 μg/ml、100 μg/ml、200
μg/ml。第一次的篩選是在液體培養基中進行，后兩次篩選是在固體培養基上。
突變體 N△5 經過 3 個循環的定向進化（包括隨機突變和 DNA 混編）（見 16.3.5)，被損功能得以恢復。在這 3 個循環中得到 19X103 個，147X103 個和 260X103 個的克隆，分別在 20 μg/ml，100 μg/ml 和 200 μg/ml 氨芐抗性板上生長 [ 步驟（6 )]，得到 3600~7000個克隆。
表
16.1 總結了所有在 3 個混編循環（S1~S3 ) 的定向進化中得到的克隆的測序結果。另外，表 16.1
還包括了每個野生型殘基的相對溶劑可接觸性和平均側鏈原子溫度因子（由 PDB 1btl )[ 37] 。其中在第二個循環后的 5
個突變體有兩個突變，M182T 和 T265M ( 根據 Ambler et al. 命名，這兩個突變在第一次循環后已經存在。
經過最后優化步驟，收集突變庫，在不用
IPTG 誘導的情況下，決定最大氨芐抗性濃度，見 16.3.4 ( 圖 16.3)。能長出顯著數目的克隆數的抗性是 700 μg/ml，經過
40 h 的培養，克隆可在含 1000 μg/ml 的抗性上生長。相比，野生型只能在 500 μg/ml 的抗性上生長。從含 800 μg/ml
和 1000 μg/ml 的抗性板上挑取 26 個克隆，并測序。26 個克隆屬于 15 個不同的突變體（表
16.1)。所有的克隆有兩個共同的突變位點，M 182T 和 A224V。以
前的研究表明 M182T 突變體能夠互補折疊缺陷 [39] 和穩定性缺失 [ 29，40 ]。突變體 A224V 在第三次循環中提高選擇壓力。這個突變體曾經被提到過，但并沒有實驗數據證實 [41]。
兩個突變體離截切的位點有 17A 的距離，表明是由截切引起的結構干擾的獨立互補。圖 16.4 是對 TEM- 1β-內酰胺酶最常用的一些突變殘基。通常，在單獨優化的突變體中矢變在在在整個結構中分布，而不是局部聚集在一起。
3.7 全長突變體的構建
優化的
N△5-S3/6 被再延長來研究突變對被截切后的不穩定蛋白質的互補作用。根據圖
16.2A，被截切的氨基酸重新被加上，從而得到全長基因——被命名為 FL-S3/6 的克隆。這個突變體定位在細胞間質，在 E.coli XL-1
Blue 中表達來檢測體內功能。讓人意外的是，在含氯霉素和 100 μg/ml 氨芐板上于 37°C 20 h
生長的克隆數目只有不含氨芐的對照板上的 50%。這和 N△5-S 3/6 在兩個板上得到相同數目克隆成鮮明對比。為了研究蛋白質
功能和蛋白質定位，對
FL-S 3/6 和 N△5 - S3/6
的細胞粗提液做酶活反應。沒有看到對發色底物頭孢硝噻吩的水解反應的區別，說明酶的定位是很重要的。與這些數據相符合的是在 FL- S 3/6
的純化過程中也能看到信號肽剪切的減少（見 16.3.8)。因此，可在細胞質內表達的 FL- S3/6-cyt
被克隆，該克隆用甲硫氨酸替代了信號肽以及Asp- Gly tag。為了保證在生理條件下正確的對比，與野生型內酰胺酶類似的基因（wt-
done-cyt) 也被克隆。
3.8 蛋白質表達及純化
β-內酰胺酶突變體（野生型間質定位的、野生型胞質定位的、N△5、優化的
N△5-S3/6、N△5- S5/S7 和 FL-S3/6 胞質定位的突變體）在 lac 啟動子下于 E.coli 細胞中帶 His -tag
融合表達（見 16.3.8.1)。通過兩步純化反應進行純化，首先用底物相似的親和層析苯基硼酸鹽柱子（見 16.3.8.2 )，再用 IMAC (
見 16.3.8.3 )。這種純化步驟非
常適用于 N△5 (圖 16. 5 ) 和 N△5- S3/7 突變體的純化。
對于某些
β-內酰胺酶突變體（野生型、N△5- S3/6、FL-S3/6)，其純化的蛋白質有很高的污染并呈未加工完全的形態（30%~ 65% ; 見注 7
)，極可能是因為過表達或者折疊太快造成的。由于即使是對旨在高產率的細胞間質提取物純化也會引入污染，所以疏水親和層析（ HIC )
被用來將蛋白質的自然形態與那些疏水性極高的未加工完全
的蛋白質形態分離開來（見 16.3.8.4)。
細胞質表達的 β-內酰胺酶變體 wt-clone-cyt 和 FL-S3/6-cyt 用苯基硼酸鹽親和柱和 IMAC 進行純化。可用離子交換柱進一步純化（見 16.3.8.5) 。
3.8.1 蛋白質表達和細胞破碎
( 1 ) 將質粒轉化到合適的表達菌株（如 BL21)
( 2 ) 從甘油菌挑菌到 2YT/Cm 培養液中，在 28°C 培養 16~18 h ( 見注8 ) 。
( 3 ) 用過夜菌擴培 4 個 1L-2YT/Cm 培養液，起初 OD600 為 0.15，在 24°C 培養 N△5 克隆，在 25~30°C 培養其他克隆（見注 9 )。
( 4 ) OD600 為 0.7 時，用 0.5 mmol/L IPTG 誘導細胞。誘導 40 min 后，加入 100 μg/ml 氨芐來篩選表達內酰胺酶的細胞。
( 5 ) 誘導 4~5 h 后（OD600 為 4~5)，用 GS-3 轉子收菌，在 -80°C 凍存。
( 6 ) 為了純化，將菌（1 L 表達菌液）懸浮在懸浮緩沖液（見注 10 ) 中，加入 200 U 的 benzonase 酶。
( 7 ) 在 97MPa ( 約 14000 psi) 下反復循環 6 次破碎預冷細胞，要一直將樣品放在冰上。
( 8 ) 將上清液用 SS-34 轉子離心，41000 g，離心 40 min。用 0.45 μm 磺酸多醚注射過濾器過濾上清液。
3.8.2 苯硼酸親和層析柱
( 1 ) 將 2 ml 苯硼酸鹽柱用懸浮緩沖液懸浮，將 16.3.8.1 步驟（8 ) 中得到的上清液上樣到親和柱中，用懸浮緩沖液沖洗直到 280 mn 的吸收達到基線。
( 2 ) 用硼酸緩沖液洗脫 β-內酰胺酶突變體。
( 3 ) 用 12.5% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE) 來鑒定蛋白質純度，用考馬斯亮藍染色。
3.8.3 金屬親和柱
( 1 ) 用含 5 mmol/L 咪唑或不含咪唑的磷酸緩沖液平衡 4 ml Ni-NTA 柱子，然后將 16.3.8.2 步驟（2 ) 的樣品上柱。
( 2 ) 用含咪唑分別為（5%、10%、16% 和 100% ) 的梯度緩沖液洗脫樣品。
( 3 ) 用 12.5% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE) 來鑒定蛋白質純度，用考馬斯亮藍染色。
( 4 ) 為了進一步純化，在含有 1 mmol/L EDTA 的 1 L 磷酸緩沖液中透析純化的蛋白質（約 8 h)，重復 3 次。
3.8.4 疏水作用色譜法
( 1 ) 用 1 mol/L (NH4)2SO4 平衡 1 ml 苯基硼酸鹽柱。
( 2 ) 將 16.3.8.3 步驟（2 ) 或 16.3.8.2 步驟（2 ) 得到的樣品加入硫酸氨到終濃度為 1 mol/L (NH4)2SO4 (見注 11)，離心（10 min；27000 g；4°C；SSr-34 轉子）并過濾（ 0.45 μm 過濾器）用以制備澄清樣品。
( 3 ) 將樣品上樣到 HIC 柱子上，用 30 ml 含 0~100% 0.5X 磷酸的線性梯度緩沖液沖洗。疏水越強的部分與柱子結合越緊密。
( 4 ) 如果是苯基硼酸鹽親和層析后直接上 HIC 柱子，樣品需要進一步用 IMAC 來純化（見 16.3.8.3)。
3.8.5 離子交換層析
( 1 ) 將 16.3.8.3 步驟 (2) 中得到的樣品在 1~1.5 L Tris-HCl 緩沖液中透析 3~4 次。
( 2 ) 用 Tris-HCl 緩沖液平衡 Mono Q 離子交換柱并上樣。
( 3 ) 用 30 ml 0~100% Tris-HCl-NaCl 線性梯度 0~100% 緩沖液洗脫。
( 4 ) 將洗脫得到的樣品用節 16.3.8.3 步驟（4 ) 所述方法透析。
所有突變體的氨基酸組成由電噴霧質譜法分析得以證實其符合計算質量的偏差范圍。酶按照節
16.3.8.3 步驟（4 ) 所述方法透析，并在純化一周內進行鑒定。在用之前，酶液需要用離心方法（30 min；15000 g；10°C )
澄清，蛋白質濃度由在 280 nm 處的吸收光譜測定（見注 12)。
3.9 酶活反應
β-內酰胺酶突變體酶活反應參數是根據發色底物頭孢硝噻吩在 486 nm 的光譜來測定的。
(
1 ) 在 980 μl 頭孢硝噻吩溶液中加入 20 μl 酶的稀釋液，混合均勻后立即在 486 nm 處測定在大約 1 min
內的吸收值的變化（見注 13)。對于起始缺失突變，我們采用的酶的終濃度為 2.5 nmol/L，對于其他變體則為 0.5 nmol/L。
( 2 ) 上述測定過程被重復至少兩次并計算標準偏差。
動力學常數是在 25°C 下，在含 0.5% 二甲基亞砜的 50 mmol/L 的磷酸鉀緩沖液 ( pH 7.0 ) 中，以 β-內酰胺化合物頭孢硝噻吩為底物測定的。
3.9.1 米氏常數的測定及轉化率的計算
( 1 ) 為了測定米氏常數（KM )，反應初速率是在底物濃度為 10~500 μmol/L 時，用 2.7~5.9 nmol/L 的 N△5 或 0.5 nmol/L 其他變體來測量完成的。
( 2 ) 將數據輸入到米氏方程，如用程序 SigmaPlot (SPSS) 提供的 MarquardtLevenberg 運算法來得到。
N△5 的 KM 值與野生型相比沒有變化，但是轉化率 K 降低了 6 倍，表明活性位點的構成對底物的結合是充分的，但并不能使有效的催化反應發生（表 16.2 )。
3.9.2 熱活性描述及半衰期
為了檢測和比較對溫度依賴的活性和熱誘導失活的動力學參數，進行了熱活性篩選。我們測定了在 25~70°C 溫度范圍提高溫度時反應的轉化率（圖 16.6)。
( 1 ) 為了檢測熱活性，配制 292 nmol/L 的 N△5 突變體溶液及 25 nmol/L 的其他突變體溶液，并分裝成 3 等份。
( 2 ) 將第一等份在已給定溫度下（25~70°C ) 的水浴中放置 5 min。其余兩等份仍在冰上保存。
( 3 ) 在檢測之前，輕微的將樣品混勻。
( 4 ) 將 20 μl 樣品加入到 980 μl 提前在反應溫度下預熱的頭孢硝噻吩溶液中，反應初速度在 5?25 s 由加熱的光譜儀測得。
( 5 ) 將第二等份在相應的溫度下預熱 30s，然后按照步驟 （3 ) 和（4 ) 所述測酶活。
( 6 ) 把第三等份在冰上放置 10 min 后測酶活。
( 7 ) 將上述步驟在不同溫度下進行重復。
野生型的熱活性主要依賴于預熱處理（圖 16.6A )。在冰上放置或預熱 30 s 的酶，其反應的最優溫度是 40°C。然而，當酶預熱 5 min 后，其最優反應溫度降至 35°C，這表明溫度依賴的去折疊的出現。
N△5
突變體在 25°C ( 所檢測的最低溫度）下有最高酶反應活性（圖 16.6C）。隨著溫度的升高，酶活迅速降低，當達到 40°C
時，酶活為零。一個詳細的在冰上溫浴后在 40°C 下測酶活實驗表明，酶是在檢測過程中被熱失活的，而且發生在將酶加入反應液后的僅數秒內（圖
16.7A )。隨著溫度的升高，酶活降低，通過指數衰減公式（見注14)，可算得半衰期在 40°C 下為 7s ( 圖
16.7B)。N△5-S3/6 突變體在 0s 和 30s 的熱活性與野生型很相似。然而，5 min
預熱后的情況則很不一樣。與野生型相比，N△5-S3/6 突變體的熱活性提高大約 8℃ ( 圖 16.6 A 和 F )。
全長的優化突變體
FL-S3/6-cyt ( 圖 16.6 E ) 展示了比優化缺失突變體 N△5-S3/6 以及相應的野生型 wt-clone-cyt
更好的熱穩定性（圖 16.6 B 和 F) 。這些酶的活性在 40°C 以內很相似，而與預熱與否關系不大。在溫度高于 50°C 時，FL-S
3/6-cy 保持了顯著較高的酶反應活性，尤其在延長熱壓力到預熱 5 min 的情況下。在冰上放置的野生型胞質內酰胺酶的最佳催化活性是在
45°C 下，而預熱 5 min 后則降到 35°C。與之相比，FL-S 3/6-cyt 的最佳溫度（50°C )
則保持不變。只是溫浴后的反應速率有所下降。有意思的是，野生型和胞質野生型內酰胺酶的 N 端氨基酸（Met 取代 AspGly)
的轉換影響著酶的穩定性。
對所有截切突變體和全長突變體的 5 min 預熱后的熱活性的比較（圖 16.6F)
闡明了末端截切是怎樣在 35?40°C 使活性減小的。補償氨基酸后能夠使活性得以恢復，甚至提高穩定性。經過再延長優化了的 S 3/6
突變體進一步提高了酶的熱穩定性和熱活性。
3.10 尿素誘導的去折疊和數據分析
β-內酰胺酶突變體的去折疊是通過熒光分光光度計來檢測的。色氨酸固有的最大熒光發射值的紅移作為與尿素濃度相關的函數來測定（圖 16.8，表 16.3 )。根據三態模型進行數據分析。
( 1 ) 將 300~400 nmol/L 的酶溶液 [ 見 16.3.8.3 ( 4 ) ] 用 0.25~8 mol/L 的尿素在 19°C 下平衡 18~20 h。
( 2 ) 在 20~23°C，記錄 320~380 nm 的突光發射被譜。對每個數據點來說，平均掃描 4 次。
( 3 ) 如果需要，則根據溶液（含有變性劑的磷酸緩沖液）背景熒光來校正熒光光譜。
( 4 ) 從熒光強度譜中算出 λmax 值。我們運用了程序 SiigmaPlot ( 見注 15 ) 中的權重功能（tribute weighting) 來完成此計算。
( 5 ) 分析假定得到的合適去折疊模型的數據。
蛋白質的變性（圖
16.8，見注 17 ) 與熱活性（圖 16.6，16.3.9.2 ) 是相吻合的。穩定性最不好的是 N△5
突變體，然后是野生型胞質內酰胺酶。優化的突變體 N△5 -S3/6 和 N△5 -S3/7 在相同的尿素濃度下開始去折疊，被延長的
FL-S3/6 突變體是最后一個去折疊的。
野生型胞質內酰胺酶和 N△5 的去折疊表現了很明顯的三態去折疊。FL/S3-6-cyt
突變體數據也表現了很好的三態去折疊。N△5-S3/6 和 N△5-S3/7
突變體數據既可以用二態，也可以用三態去折疊來解釋。相比而言，所有的數據都能用三態模型 NIU，式( 1 ) (步驟（6 )，表 16. 3 )
來解釋。這種方法由以前 TEM - 1 β -內酰胺酶去折疊中間態折疊模型支持 [42~44]
。尿素處理后第一次變性的酶顯示了降低的活性。從中得到的熱力學值可以幫助比較和解釋所得的突變體，但需謹慎使用，因為這是在假設的基礎上得到的。去掉前
5 個 N 端的氨基酸（主要影響第一過渡態），穩定性被降低 10
kJ/mol，對第二過渡態的影響不大。催化活性的體內優化得到對兩個過渡態都有穩定作用的突變體，所得突變體在第一過渡態的穩定性在野生型之下，而第二過渡態的穩定性則在其之上。與
N△5-S3/6 相比，延長的 FL-3/6-cyt 明顯穩定了第一階段（19.6 kJ/mol)，但對第二階段的影響不大（3.8
kJ/mol)。這與延長補償截切突變體不受引入突變的干擾的現象是相符合的。與野生型胞質內酰胺酶 wt- clone-cyt
相比，FL_S3/6-cyt 的穩定性在第一過渡態增加了 15 kJ/mol，在第二次過渡增加了 11.4
kJ/mol。需要注意的是優化的突變體與野生型相比在更高的尿素濃度下才會變性，證實了在熱活性實驗中觀察到的穩定性排序。
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