對于僅僅知道某種蛋白質的部分序列，而要克隆其基因的最佳方法是，利用已知氨基酸序列設計相應的寡核苷酸，用此寡核苷酸作為探針去篩選基因文庫釣取全長基因或者用寡核苷酸作為引物進行 PCR 擴增靶基因。這兩種方法都會遇到寡核苷酸所編碼的 遺傳密碼子的簡并性問題。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 對于僅僅知道某種蛋白質的部分序列，而要克隆其基因的最佳方法是，利用已知氨基酸序列設計相應的寡核苷酸，用此寡核苷酸作為探針去篩選基因文庫釣取全長基因或者用寡核苷酸作為引物進行 PCR 擴增靶基因。這兩種方法都會遇到寡核苷酸所編碼的遺傳密碼子的簡并性問題。 |
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| 實驗材料 | 熱穩定 DNA 聚合酶DNA 模板反義寡核苷酸庫正義寡核苷酸引物庫 |
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| 試劑、試劑盒 | 擴增緩沖液dNTP 貯存液 |
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| 儀器、耗材 | 聚丙烯酰胺凝膠屏蔽型槍頭離心管正向排液式移液器PCR 儀 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液與溶液
10X 擴增緩沖液
4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L，pH 8.0 )
2. 酶與緩沖液
熱穩定 DNA 聚合酶
3. 凝膠
聚丙烯酰胺凝膠
4. 核苷酸與寡核苷酸
DNA 模板（100 μg/ml，基因組 DNA 或 cDNA 基因文庫）溶于 TE 中（pH 8.0)
反義寡核苷酸庫（10 μmol/L）溶于 TE 中（pH 8.0)
正義寡核苷酸引物庫（10 μmol/L）溶于 TE ( pH 8.0)
5. 特殊設備
自動微量移液器的屏蔽型槍頭
離心管（0.5 ml，薄壁擴增反應專用離心管）
正向排液式移液器
PCR 儀
二、方法
1. 按以下次序，將各成分加入到一只 0.5 ml 滅菌離心管、擴增管或滅菌微量滴定板的孔內，混合：
0.5 μg 模板 DNA 5 μl
10X 擴增緩沖液 5 μl
20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液（pH 8.0） 5 μl
10 μmol/L 正義引物庫（70 pmol） 7 μl
10 μmol/L 反義引物庫（70 pmol） 7 μl
1~2 單位熱穩定 DNA 聚合酶 1 μl
H2O 補足至 50 μl
設置幾支對照反應管。在一只對照管中加入除了模板 DNA 外的所有上述試劑。第二支加入除去一種引物以外的所有上述試劑。
2. 如果 PCR 儀沒有配備加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴礦物油（約 50 μl），防止樣品在 PCR 反應多個加熱與冷卻的循環過程中蒸發。如果應用熱啟動 PCR 程序，在反應混合液的上層加一層石蠟油。放置離心管和微量滴定板在 PCR 儀上。
3. 按以下方法進行 PCR 擴增。典型的程序有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：
4. 抽取每種擴增樣品 5~10 μl 用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析擴增結果，用 DNA marker 來判斷擴增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠）或 SYBR 金顆粒染色后來觀察擴增的量與片段大小。
如果針對一條連續氨基酸序列設計正義和反義引物用于 MOPAC 反應，目的擴增產物的大小將是已知的。在大多數情況下，薄層聚丙烯酰胺凝膠（<6%) 可用于能分辨核苷酸序列大小的分級分離使目的產物獲得明確的鑒定。一種鑒定方法為擴增產物能被末端標記和進行其化學序列分析確定與兩套寡核苷酸庫相結合的一條惟一的序列。這種惟一序列最終能被合成和用于作為分離與篩選更長的 cDNA 基因的探針。另一種可供選擇的方法是，MOPAC 產物自身在第二輪 PCR 中被標記和用作探針。如果酶切位點被設計在起始寡核苷酸引物的 5' 末端，因而這種擴增片段經相應的內切酶清化后易于克隆到相應的質粒或噬菌體載體上。
5. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內樣品液體的上層，反應結束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。
在 PCR 反應管內，包含擴增 DNA 片段的水相與上層礦物油的界面形成彎月面，在彎月面下面的水相還有微膠粒。可用自動移液器小心吸取水相液體轉移到一個新的離心管內。
為了許多目的，如用 Cemricon 微量濃縮器純化擴增 DNA 片段，或者克隆擴增產物，在進行實驗操作前去除反應管上層的油相是必要的。
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