材料和方法
樣品
此報道中用到的野生型RET基因的DNA基因組樣品或有RET序列變化的樣品在以前描述過。RET基因序列變化改變RET蛋白的功能引發MEN2綜合癥的是突變，然而RET序列改變不會引發MEN2綜合癥是多態。不能確定意義的稀有的或不會引起MEN2綜合癥的RET基因序列變化成為“序列變化”。在這份報告中，通過密碼子數列出RET序列變化，野生型編碼DNA序列后面是編碼序列改變，伴隨著加粗突變核苷酸（例：618（TGC→TAC）），反之多態及序列變化用下劃線標出。所有測試的RET序列變化的樣品均有單個核苷酸改變，并且是雜合的除非有另外的闡明。RET突變基因型和多態性及序列變化基因型列于表1。
*序列變化是雜合的除非在文本上另作說明。密碼子DNA序列列出核苷酸改變，加粗突變且多態性或序列變化使加下劃線的。?，可用的RET序列變化樣品。
?未知意義的稀有序列變化或不引發MEN2綜合癥；查看參考文獻。在RET致病密碼子范圍內密碼子609或611的3個突變體與MEN2綜合癥沒有聯系。密碼子922和852的突變體以前在MTC病人上發現過，也許不會引發MEN2綜合癥。
?良性多態性，0.26等位基因頻率。
§806與804突變在同一等位基因時致病。
引物和探針
用完整DNA技術合成寡核苷酸。用Primer3設計引物。選擇引物和探針檢測所有已知RET突變，不包括分析中的普通多態（表2）。非標記探針包含有3’磷酸化或3’氨基修飾（整合DNA技術），避免PCR反應中的延伸。設計的探針用于分析每個外顯子的突變熱點。
RET基因分型實驗中用了4種非標記探針（表2）：野生型（WT）探針，特定突變（MS）探針，只遮蔽單一多態核苷酸的遮蔽探針，遮蔽3個多態核苷酸的位置探針（一個密碼子）。比如說，外顯子13遮蔽探針（遮蔽1bp
769）在多態核苷酸位置有單個堿基的缺失。（WT13探針的“T”位置，表2）。外顯子10和11位置探針與野生探針序列相比有3個核苷酸缺失，遮蔽一個致病密碼子分辨密碼子突變的位置。外顯子10和11在致病密碼子位置有同樣的序列改變。比如說：外顯子10，MS618/620TAC探針在密碼子618-620有TAC序列，
如表2描述。
*最終引物的濃度和上下引的比例在引物序列上顯示。列出引物序列從5’到3’，上游引物在下游引物上部。
?每個探針集下是密碼子的變化。下劃線密碼子包括了多態或序列變化，反之其它密碼子包括突變。
?遮蔽，遮蔽1-3個核苷酸的缺失。主要實驗中的野生型探針序列用于每個外顯子，除了外顯子16。如果兩個野生型探針用于一個外顯子，標記做A和B探針。
§探針序列從5’到3’顯示，RET外顯子10、13、14和16是上游探針，反之，外顯子11是下游探針。已知突變的位點加粗，可能的多態性或序列變化位點用下劃線表示。
?位置（L）探針與野生型探針序列致病密碼子相比有3個核苷酸遮蔽缺失（---）。
‖用于外顯子10,11突變的基因分型的MS探針的例子。在探針內致病密碼子位置的相同的特定突變序列。這些探針有特定突變序列的名稱，改變的序列加粗。有7個可能的從TGC
野生型半胱氨酸到其他氨基酸的突變序列改變。因此，21個MS探針中的7個特定突變探針（AGC，CGC，GGC，TAC，TCC，TTC，TGG）是用于外顯子10和11突變。用于每個突變基因分型的MS探針用圖解法表示，表3和補充表格1-5。
**外顯子13的主要和第二次試驗用遮蔽探針。遮蔽 1bp 769 主要探針及外顯子特定突變探針在密碼子769多態位置有單核苷酸缺失（缺失野生型探針序列有下劃線的“T”）。
??外顯子16用918（ATG-ACG）密碼子特定突變探針做主要實驗。
PCR
用之前描述的不對稱快速PCR擴增樣品DNA，除了用表2中給出的引物濃度反應55個循環。外顯子14反應包括2個探針，0.5μmol/L的WT14A探針和0.25μmol/L的WT14B探針。在主要實驗和第二次實驗一個野生型對照與每個探針一起參加反應。外顯子13， WT13主要的實驗反應用2個額外的對照：雜合和純合密碼子769樣品。外顯子10主要實驗反應用620（TGC→AGC）突變樣品作為正對照。