外顯子10和11：多重突變熱點
MEN2A和FMTC的主要突變位于外顯子10（密碼子609、611、618和620）和11（密碼子630和634），且野生型半胱氨酸的密碼子DNA序列“TGC”發生單核苷酸改變。外顯子10和11報道的序列變化>40（表1）。
RET10外顯子的主要實驗包括兩個單獨的實驗和兩條探針。WT10A探針覆蓋了密碼子611和609，WT10B探針覆蓋了密碼子618和620（圖1a）。所有密碼子618和620突變的樣品在WT10A探針下有野生型序列且有和野生型對照樣品的Tm值相同（圖1b）。五個密碼子609和611樣品中的每一個都含有一個突變等位基因，比野生型等位基因的熔解溫度要低。相反的，WT10B探針，密碼子609和611突變樣品的Tm值和野生樣品的相同，但是每10個密碼子609和611突變樣品有一個突變等位基因，熔解溫度比野生型等位基因低（圖1e）。外顯子10所有的RET序列變化通過用高分辨率熔解曲線分析的標準化熔解曲線，派生圖或熒光信號的不同數據（圖1、c、d、f和g；數據沒有顯示）來檢測。這些數據證實了不在非標記探針下的突變可以用擴增熔解數據檢測出來（例：圖1中比較藍色突變的痕跡，b對c）。
圖1：檢測RET外顯子10序列變化的主要實驗。a：RET10外顯子10的圖示，紅色方塊顯示密碼子609和611，藍色的方塊顯示密碼子610和620。外顯子10的主要實驗用WT序列的兩個非標記探針。如圖所示，WT10A探針檢測密碼子609和611突變，反之WT10B檢測密碼子618和620突變。每個圖中，顯示一式兩份三個野生型對照（WT，黑色痕跡），及一式兩份（紅色痕跡）兩個密碼子609和三個密碼子611突變樣品、五個密碼子618和620突變（藍色痕跡）。3個左面的圖是WT10A探針反應的非標記探針和擴增子的高分辨率熔解數據，右面的3個圖是WT10B的數據。對于每個探針，最厚重的痕跡線與探針檢測的突變一起使用，稀疏的痕跡線只于擴增子檢測的突變一起使用。b：WT10A探針數據的派生熔解圖。等位基因分為兩個Tm范圍，且每個范圍有預測的密碼子突變等位基因（609/611突變或618/620突變），與WT等位基因一起列出。c：WT10A探針與WT主要實驗和標記的外顯子10突變樣品的擴增派生熔解曲線。d：同樣擴增數據的不同平面圖。e：WT10B探針的數據的派生熔解平面圖。等位基因分為兩個Tm范圍，且每個范圍有預測的密碼子突變等位基因，
與野生型等位基因一起列出。f：WT10B探針與野生型主要實驗和標記的外顯子10突變樣品的擴增派生熔解曲線。g：同樣擴增數據的不同平面圖。
在主要實驗中用野生型探針識別每個探針下的野生序列，樣品Tm值與野生型對照等位基因Tm值相差±0.25℃（表3；補充表1；http://jmd.amjpathol.org）。RET序列變化的樣品有一個等位基因，其Tm值小于野生型等位基因，△Tm值>0.25℃。限制在第二次實驗中基因分型需要的特定突變探針的數目，△Tm值范圍用于安裝相似的△Tm值分組RET序列變化。△Tm值值的范圍用于快速生成Tm標線，視覺上選擇第二次試驗探針。例如：圖2a的WT10B探針數據顯示13個樣品通過Tm標線，視覺上分為一個野生型組和兩個突變組。第一個突變組，包含密碼子618或620的TAC、TCC、TTC和TGG，△Tm值在3.3℃到5℃的△Tm范圍內（圖2a；表3；補充表1；http://jmd.amjpathol.org）。這一組的樣品在第二次實驗中MS10B的探針集1需要4個探針（圖2，b-e）。第二個突變組，包括密碼子618和620的
AGC、CGC和GGC突變，△Tm值在0.25℃到3.3℃的△Tm范圍內。這個突變組在第二次實驗中MS10B的探針集2需要3個探針（圖2，f-h）。相同的方法用于包含密碼子609和611突變的WT110A探針數據（表3；補充圖1；補充表2；http://jmd.amjpathol.org）。外顯子10的主要實驗用的△Tm值來自于兩個外顯子10的野生型探針限制來自28至≤8基因型未知突變的可能基因型。
為了減少第二次實驗中基因分型突變所需的探針的數目，外顯子10的每個特定突變探針在致病密碼子范圍有相同的序列改變（表2）。一個致病密碼子的補充突變等位基因導致與探針只有一個錯配，且Tm值比有兩個錯配（表2，b-h）的野生型等位基因高2℃-5℃ 。如果突變在不同的位置，突變等位基因與探針有三個錯配，且熔解Tm值低于野生型（例，圖2 TGG突變，b-d，粉色痕跡）。如果突變與探針序列改變在同一位置，但是不與探針互補，此時突變等位基因的Tm值接近于野生型等位基因的Tm值，因為這個等位基因與探針有兩個錯配。分析時，如果與野生等位基因熔解曲線不相同，這些突變等位基因因為熔解曲線相似而被遮蔽（如：圖2g遮蔽的AGC和GGC，紅色和灰色的痕跡）。偶爾，一個突變等位基因和非互補特定突變探針會顯示比預期高的遮蔽熔解。例如：密碼子618（TGC→TCC）和620（TGC→TCC）突變比野生等位基因和MS618/620TAC和TTC探針（圖2， b和d，橙色痕跡）較穩定（△Tm-1.7℃至-2.0℃）。即使如此，兩個雜合TTC突變通過與互補MS618/620TCC探針（△Tm-4.7℃）的較高的Tm值而容易區分（圖2c，橙色痕跡）。
不管突變的位置在哪，在探針下的致病密碼子的同樣的突變序列改變與主要探針數據的派生熔解圖非常相似（圖1和2a；補充圖1a；http://jmd.amjpathol.org）。比如說，密碼子618（TGC→TAC）和620（TGC→TAC）突變通過主要的非標記探針或擴增子熔解曲線彼此不能區分。另外，設計的第二次特定突變探針只決定突變的序列，不識別突變的密碼子位置。第二次實驗中包括了檢測外顯子10序列變化的一個位置探針，識別突變的密碼子。“L10B 620 mask” 位置探針，設計時含有一個遮蔽，在密碼子620位置上的野生探針序列有3個核苷酸（密碼子）缺失（表2），用于區分密碼子618和620突變。密碼子620突變等位基因與野生型等位基因的Tm值相似，所以被屏蔽，反之，610密碼子突變等位基因的Tm值低于野生型（圖2）。位置探針允許外顯子10特定突變探針設計與兩個分析的密碼子的序列的改變相同，因此減少了第二次實驗所需的特定突變探針的數目的1/2。任何被主要實驗檢測到的外顯子10的突變只用一個位置探針和三至4個特定突變探針進行基因分型。